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急性缺氧中UCH-L1在调控α-Syn中的生物学作用

发布时间:2019-09-29

 

  急性缺氧是机体在短时期内出现供氧不足或者组织供氧量不足的状态,从而导致机体组织能量代谢异常,引发代偿性和损伤性反应。脑是机体中对缺氧最敏感的组织之一,缺氧可引起认知功能损伤等神经性疾病,严重时可导致脑死亡。因此,探讨机体对低氧的感知和应答能力对维持脑正常生理功能具有重要意义。α - 突触核蛋白( α - synuclein,α -Syn) 是一种小分子酸性可溶性蛋白,主要分布于脑内新皮层、海马、嗅球、背侧丘脑、纹状体、下丘脑、黑质及小脑等部位的神经元胞液中〔1〕。α -Syn 表达异常、聚集与神经退行性等多种疾病关系密切。泛素羧基末端水解酶 L1( ubiquitin C - terminal hydrolaseL1,UCH - L1) 是泛素 - 蛋白酶体系统中的重要成员,除了具有去泛素化作用外,还有泛素连接酶和稳定细胞内泛素单体的功能〔2〕。有研究发现,UCH - L1 与 α- Syn 存在直接相互作用,可能在调控 α - Syn 表达水平中具有重要作用〔3〕。本研究利用 UCH - L1 基因敲除小鼠,探讨急性低压低氧条件下,UCH -L1 功能缺失对小鼠海马中 α - Syn 表达水平的影响,以期为阐明UCH - L1 在调控 α - Syn 中的生物学作用,以及治疗与 α -Syn 蛋白相关的神经系统疾病提供科学依据。
  
  1 材料与方法
  
  1. 1 实验动物 UCH - L1 基因杂合子 ( UCH -L1+ / -) C57BL/6J 小鼠由本实验室从美国 MMRRC 购买后繁殖获得〔4〕。利用雌性和雄性 UCH -L1 杂合子小鼠繁殖子代幼鼠,经基因型鉴定后,选取12 周龄的雄性野生型小鼠( UCH -L1+ / +) 和 UCH -L1 基因敲除纯合子小鼠( UCH -L1- / -) 用于实验。所有小鼠均饲养于军事医学科学院卫生学环境医学研究所SPF 级动物房。
  
  1. 2 主要试剂与设备 DNA 提取试剂盒和 2 × TaqPCR MasterMix( TIANGEN) ,引物由北京英杰生命科技有限公司合成,兔抗 UCH -L1 多克隆抗体和 PVDF 膜( Millipore 公司) ,兔抗 LC3 多克隆抗体和 PMSF( phe-nylmethanesulfonyl fluoride,苯甲基硫酰氟,Sigma 公司) ,兔抗 α - Syn 多克隆抗体( abgent 公司) ,辣根过氧化物酶标记 GAPDH( glyceraldehyde -3 - phosphatedehydrogenase,甘油醛 -3 - 磷酸脱氢酶,上海康成生物公司) ,RIPA( radio immunoprecipitation assay) 裂解液( 碧云天生物技术研究所) ,BCA 蛋白浓度测定试剂盒( Boster 公司) .低压氧动物舱( 烟台宏远公司) ,Multi-skan MK3 酶标仪( Thermo Electron 公司) ,蛋白质垂直电泳和转移系统( Bio -Rad 公司) .
  
  1. 3 PCR 方法鉴定小鼠基因型 幼鼠出生后 4 周与母鼠分离,并从尾部尖端剪取长约 0. 5 cm 组织,按照基因组 DNA 提取试剂盒的操作步骤提取小鼠基因组 DNA.根据我们实验室已经建立的 PCR 方法鉴定小鼠基因型〔4〕。PCR 产物利用 2% 琼脂糖凝胶电泳分析,野生型小鼠( UCH - L1+ / +) 的扩增产物为 1 条 213 bp 大小的片段,杂合子小鼠( UCH -L1+ / -) 的扩增产物是 2 条分别为 213 bp 和 447 bp大小的片段,纯合子小鼠( UCH - L1- / -) 的扩增产物为 1 条 447 bp 大小的片段。
  
  1. 4 急性低压低氧动物模型 急性低压低氧组置于低压氧舱内,以 15 m/s 的速度上升至海拔 3000 m高度停留 3 min,然后以同样的速度上升至海拔5000 m 停留 5 min,最后上升至海拔 8000 m,持续 8 h,实验结束后以 15 m/s 的速度降至海平面。对照组常规饲养,不进行低压低氧处理。
  
  1. 5 Western blot 检测蛋白表达水平 小鼠麻醉处死后迅速取出海马组织置于液氮中保存。每侧海马组织加入200 μl RIPA 蛋白裂解液于冰浴中的玻璃研磨器中研磨,吸取研磨液置于 EP 管中,以 12 000 r/min,离心 30 min( 4 °C) ,取上清。BCA 法定量。蛋白样品( 40 μg/lane) 经十二烷基磺酸钠( SDS) -聚丙烯酰胺凝胶( PAGE) 电泳分离,电转移至 PVDF 膜上。
  
  PVDF 膜经 5% 脱脂奶粉封闭 1 h 后,分别用抗 UCH- L1 抗体( 1: 1000) 、抗 LC3 抗体( 1∶ 1000) 、抗 α -Syn 抗体( 1∶ 300) 和抗 GAPDH 抗体( 1∶ 10 000) ,4 °C 孵育过夜,PBST 洗膜 3 次后,与辣根过氧化物标记山羊抗兔 IgG ( 1∶ 10 000) 孵育1 h,洗膜3 次后,化学发光显色。
  
  1. 6 图像观察和分析 采用 Image J 软件分析蛋白条带的吸光度值。以 GAPDH 作为参照,目标蛋白与内参吸光度的比值代表目标蛋白的相对表达量。结果用平均数 ± 标准差( x珋 ± s) 表示,所有数据用SPSS 19. 0 软件进行分析。
  
  2 结果
  
  2. 1 小鼠基因型鉴定 根据孟德尔遗传定律,雌雄双杂合子交配,其子代可能出现野生型( UCH -L1+ / +) 、杂合子( UCH - L1+ / -) 及纯合子( UCH -L1- / -) 3 种基因型。剪取子代幼鼠尾尖部提取DNA,测定吸光度值( A) 范围均在 1. 8 ~ 2. 0,符合PCR 模板要求。PCR 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定小鼠的基因型。图 1 所示为同一窝小鼠的基因型鉴定结果,从图中可判断 1、2、4 和 7 号小鼠的基因型为 UCH - L1+ / +,3 号小鼠的基因型为 UCH -L1- / -,5 和 6 号小鼠的基因型为 UCH - L1+ / -.
  
  2. 2 急性低压低氧对野生型小鼠海马中 α - Syn 和UCH - L1 表达的影响 野生型小鼠经急性低压低氧处理后,检测海马组织中 α -Syn 和 UCH -L1 蛋白表达水平的变化。结果显示,与未处理对照组( 0. 702 ±0.121) 相比,急性低压低氧组海马中 α - Syn 蛋白表达水平( 1.310 ±0.096) 升高,P <0. 05( 图 2A) ,而 UCH- L1 蛋白表达水平在两组间没有明显差异( 图 2B) .
  
  2. 3 UCH - L1 基因敲除对急性低压低氧小鼠海马中 α - Syn 表达的影响 将野生型小鼠( UCH -L1+ / +) 和 UCH - L1 基因敲除纯合子小鼠( UCH -L1- / -) 进行急性低压低氧处理,分别提取海马组织蛋白质,检测 α -Syn 的表达水平。结果显示,与野生型急性低压低氧小鼠相比( 1.490 ±0.074) ,UCH -L1- / -小鼠海马中 α -Syn 表达水平显着降低( 0.952 ±0. 093) ( P < 0. 05) ( 图 3) ,提示: 在急性低压低氧条件下,敲除 UCH - L1 基因促进了 α - Syn 的降解。
  
  2. 4 UCH - L1 基因敲除对急性低氧小鼠海马中细胞自噬相关蛋白 LC3 表达的影响 为了探讨急性低压低氧条件下,敲除 UCH - L1 基因促进了 α - Syn 降解的机制,检测了急性低压低氧及 UCH - L1 基因敲除对细胞自噬相关蛋白 LC3 表达的影响。结果显示,与野生型小鼠( 0.174 ±0.006) 相比,单纯敲除 UCH -L1 基因对 LC3Ⅱ/Ⅰ没有影响( 0.176 ±0.007) ; 急性低压低氧可导致野生型小鼠海马中 LC3Ⅱ/Ⅰ水平( 0.215 ±0.007) 升高,而敲除UCH - L1 基因后 LC3Ⅱ / Ⅰ水平( 0. 301 ± 0. 008) 升高更显着,P <0. 05( 图 4) .表明急性低压低氧可诱导海马出现细胞自噬水平升高,而敲除 UCH - L1 基因进一步促进细胞自噬。
  
  3 讨论
  
  α - Syn 是一个由 140 个氨基酸组成的神经元蛋白,其异常聚集是许多神经退行性疾病的发病因素之一〔5〕。研究发现,α - Syn 存在于帕金森病、路易体痴呆、多系统萎缩及若干其他神经变性病患者的路易体、路易小体神经突和寡核苷酸变性包涵体中,这些被称作为突触核蛋白病〔6〕。突触核蛋白病代表了一组神经系统变性疾病,神经元及胶质细胞内突触核蛋白聚集物的沉积是这些变性疾病的共同致病机制。
  
  因此,及时清除毒性聚集体及有聚集倾向的 a - 突触核蛋白至关重要。在细胞内,α - Syn 主要通过泛素- 蛋白酶体途径和自噬 - 溶酶体途径清除〔7〕1当这 2种途径受损伤时将导致 α - Syn 沉积。有研究发现,在体外培养海马细胞中,抑制 UCH - L1 基因表达可诱导细胞内 α - Syn 表达水平显着升高,表明在正常生理条件下,UCH - L1 调控着海马细胞内 α - Syn 的正常降解〔8〕。已知 UCH - L1 调控着细胞内泛素水平的稳定,UCH - L1 缺乏可导致细胞内泛素水平降低〔9〕,而 α - Syn 的正常降解是通过泛素 - 蛋白酶体途径,因此,在正常生理条件下,UCH - L1 具有去泛素化酶作用,在调控 α - Syn 中发挥作用。本研究探讨了急性低压低氧条件下,小鼠海马中 α - Syn 的表达水平变化及 UCH - L1 对其表达水平的调控作用。
  
  结果表明,急性低压低氧可诱导小鼠海马组织中 α -Syn 表达水平升高。根据生理条件下 UCH - L1 对 α- Syn 表达水平影响的结果〔8〕,我们推测: 在这种急性低压低氧条件下,如果敲除 UCH - L1 基因,小鼠海马组织中 α - Syn 表达将会升高得更明显。然而,实际的结果显示,敲除 UCH - L1 基因反而使小鼠海马中 α - Syn 表达水平明显降低。提示,在急性低压低氧条件下,UCH - L1 对小鼠海马组织中 α - Syn 的调控可能存在其他机制,促进了多余 α - Syn 的清除。
  
  细胞自噬是清除多余蛋白质的重要机制之一,也是 α - Syn 降解的重要途径,LC3 是重要的自噬标志性分子。当发生自噬时,LC3Ⅱ的表达水平会明显增加,因此通过检测 LC3 表达水平可以判断自噬是被诱导还是被抑制。我们初步探讨了在急性低压低氧条件下,UCH - L1 对细胞自噬相关蛋白 LC3 表达的影响,发现敲除 UCH - L1 基因后,小鼠海马组织中LC3Ⅱ / Ⅰ明显升高,提示在急性低压低氧条件下,敲除 UCH - L1 基因可能通过促进细胞自噬导致 α -Syn 表达水平降低。但其中的生物学机制尚需后续进一步研究。
  
  参考文献:
  
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