血管新生（ angiogenesis） 是指在原有血管网基础上，由血管内皮细胞出芽形成新的微血管的过程[1],而血管发生（ vasculogenesis） 则是指由中胚层的内皮前体细胞（ endothelial precursor cells,EPCs）在原位分化形成新血管的过程[2]. 血管发生被认为主要出现在胚胎形成过程中，而血管新生则在发育及多种生理、病理过程中都存在，包括肿瘤的发生、发展等。 在血管的形成、发育和血管相关疾病发生过程中，作为管脉结构内部屏障的血管内皮细胞起着关键的作用。 事实上，血管新生过程就是内皮细胞经过一系列的变化，包括细胞增殖、迁移、粘附及形成管腔结构等过程而最终形成血管，并组成血管网络。
　　
　　该过程受到很多血管生成相关因子的调控，包括促血管生成因子和血管生成抑制因子。 在成体组织中，大多数血管保持静止，引导血流； 而一旦血管生成过程失去正常的调控，促血管生成因子活性过高时，可通过激活 MAPK、PI3K 等通路而促进血管内皮细胞的增殖、迁移等[3],最终会导致很多疾病的发生。
　　
　　血管生成素（ angiogenin,ANG） 是一个 14 kD 的碱性核糖核酸酶； 1985 年基于其促血管生成活性而从结肠腺癌细胞 HT29 培养液中被分离纯化[4],且已发现 ANG 在多种肿瘤中表达上调[5]. 虽然 ANG的异常表达与多种肿瘤的发生、发展及恶化相关，具有促血管生成和肿瘤细胞增殖的双重活性，但是目前对 ANG 作用机制的了解仍非常有限。 研究发现，ANG 不仅 可 与 血管 内 皮 细胞 表 面 的 肌 动 蛋白 结合[6],激活细胞外周的蛋白酶，降解基底膜和胞外基质，促进细胞的迁移，而且可激活靶细胞的 Erk1/2、PKB / Akt 和 / 或 SAPK / JNK 信号转导通路而活化细胞[7-9]. 同时，ANG 的促血管生成活性依赖于其核转位能力。 外源 ANG 可快速进入血管内皮细胞的细胞核，特异性地定位于核仁区[10]. 目前认为，ANG通过作用于血管内皮细胞，能诱导细胞迁移[11]、增殖[12]、管腔形成[13]等细胞学事件，而这些事件正是血管生成的基本生物学过程。microRNA（ miRNA） 是一类内源性的长约 22 nt的单链小分子 RNA[14],通过与靶基因 mRNA 结合，在转录后水平对基因表达进行广泛调节，从而调控各种生理、病理过程，包括血管生成。
　　
　　本研究首先利用生物信息学方法预测了靶向ANG-3'UTR 的候选 miRNA,然后验证了它们之间的靶向关系，最后在 ANG 诱导血管生成的主要靶细胞，即血管内皮细胞中检测了这些 miRNA 对血管生成过程的影响。
　　
　　1 材料与方法
　　
　　1. 1 材料
　　
　　人脐静脉血管内皮细胞（ HUVEC） 按前所述方法[15]分离自健康新生儿脐带，COS-7 细胞购自上海中科院细胞库。 Human Endothelial-SFM（ Invitrogen,GB11111-044 ） 、M199 （ Hyclone,SH30253. 01B ） 、DMEM （ Invitrogen, GB12800-017 ） 、 胎 牛 血 清（ Invitrogen,GB10099-141） 、内皮细胞生长补加培养基 （ ECGs, Millipore,02-102 ） 、青 霉 素/链 霉 素（ Invitrogen,15140122 ） 、Typsin EDTA （ Invitrogen,GB25200-072 ） 、OPTI-MEM （ Invitrogen,31985 ） 、Lipofectamine2000 （ Invitrogen,GB11668-019 ） 、TrizolReagent（ Invitrogen,GB15596-018 ） 、NaAc （ 3 mol / L,pH5. 2） （ Amresco SE521） 、Glycogen（ BBI,GB0301） 、MMLV 逆转录酶（ Invitrogen,SKU#28025-013） 、dNTPMix（ Sangon,D0056 ） 、随 机 引 物 （ Sangon,B0043 ） 、SYBR Premix EX Taq （ TaKaRa RR420A ） 、TaqManUniv PCR MM,no UNG （ ABI,4364343 ） 、TaqmanmicroRNA RT Kit （ ABI,4366597 ） 、β-actin 抗 体（ Santa Cruz,sc-1615） 、GAPDH 抗体（ Cell Signaling,2118） . siRNA 均购自上海吉玛制药技术有限公司，引物购自上海生工。 ANG 的兔源多克隆抗体为本实验室自备[16].
　　
　　1. 2 细胞培养与转染
　　
　　细胞培养： 每 200 mL HUVEC 培养液含 HE-SFM 72 mL、M199 105 mL、FBS 10% 、ECGs 15 μg /mL 和 Penicillin-Streptomycin 1 × . Cos-7 培养液为含10% FBS 的 DMEM. 细胞置于 37℃ 、5% CO2培养箱中培养，生长至 80%融合状态时传代。 细胞转染：接种细胞，生长至 70% ~ 80% 融合状态，换成新鲜的无血清培养液，按照 Lipofectamine 2000 说明书转染 DNA、siRNA 或 miRNA; 转染后4 ~6 h 后，换成含血清的培养液继续培养 24 ~48 h.
　　
　　1. 3 RNA 提取
　　
　　用 Trizol 裂解细胞（ 1 mL/10 cm2） ,室温静置5 min,收集至离心管中； 加入 0. 2 倍体积的三氯甲烷，振荡混匀，室温静置 5 min; 12 000 g,4℃，离心15 min; 将上层液体转移至新离心管内，加入 1 /10 体积（ 上清体积） 的 NaAc（ 3 mol/L,pH 5. 2） 和 1 μLGlycogen,然后与 0. 5 倍体积（ Trizol 体积） 的异丙醇混匀，-20℃静置1 h;12 000 g,4℃，离心 10 min; 弃上清，加入 1 mL 75% 乙醇，重悬沉淀； 7 500 g,离心 5min; 弃上清，晾干沉淀； 加 30 ~ 50 μL DEPC 水溶解沉淀； 用 NanoDrop 检测 RNA 浓度，分装后 -80℃保存。
　　
　　1. 4 RT-PCR
　　
　　反转录： 反应体系总体积为 10 μL,含 DEPC 水1. 5 μL、5 × First Strand Buffer 2 μL、0. 1mol / L DTT 1μL、dNTP （ 10 mmol/L） 0. 5 μL、Random Primer（ 100 μmol /L） 0. 5 μL、M-MLV RT （ 200 U/μL）0. 5μL、Total RNA （ 50 ng / μL） 4 μL; 按照程序 25℃10 min、37℃ 2 h、70℃ 15 min 进行反应，反转录产物-20℃保存。
　　
　　荧光定量 PCR: 反应体系总体积 10 μL,含 ddH2O 2. 3 μL、2 × SYBR 5 μL、50 × ROX Dye 0. 2 μL、Primer Mix （ 1 μmol / L each） 2 μL、cDNA 0. 5 μL; 反应程序为： 95℃，30 s; 95℃，5 s、60℃，30 s （ 40cycles） ; 95℃ ,15 s、55℃ ,15 s、95℃ ,15 s. 引物序列见 Table 1. 加样，封板，离心，在 ABI 7900HT 定量PCR 仪上按照以上程序进行 qPCR.
　　
　　1. 5 质粒构建
　　
　　PCR 扩 增 ANG 全 长 cDNA,连 入 载 体pcDNA3. 1,构 建 质 粒 pcDNA3. 1-sigANG-3' UTR 用于真核过表达 ANG; PCR 扩增 ANG 的 3'UTR 基因，连入 psiCHECK-2 载 体，构 建 质 粒 psiCHECK-2-ANG3'UTR 用于双荧光素酶报告基因检测。 所有构建成功的质粒均经过 DNA 测序（ 南京金思瑞公司）分析，序列正确的用于进一步的实验。
　　
　　1. 6 免疫印迹
　　
　　用 RIPA 裂 解 液 裂 解 细 胞 提 取 蛋 白，并 用Branford 法进行蛋白定量； 取等量蛋白加入等体积 2× Loading Buffer,99℃ 加 热 5 min; 用 15% SDS-PAGE 分离蛋白后，采用湿转法将蛋白质转印至 NC膜上； 用 3%BSA-TBST 封闭 2 h,ANG 一抗按照 1∶ 1000 稀释于封闭液中 4℃ 孵育过夜，TBST 洗膜后用羊抗兔荧光二抗（ 1∶ 10 000） 室温孵育 40 min; 避光洗膜后荧光扫描检测。
　　
　　1. 7 细胞增殖
　　
　　按一定密度接种细胞于培养皿，孵育过夜； 转染miRNA 或 siRNA,培 养 24 h; 消 化 收 集 细胞，按 照2 000个 / 孔细胞密度接种于 96 孔细胞培养板中，并加入 10 ng/mL bFGF,分别在接种0、24、48、72 h 后，用 CCK-8 试剂盒检测细胞数目，进行统计分析。
　　
　　1. 8 管腔形成
　　
　　Matrigel 置冰上，放在 4℃ 过夜融化； 将 Matrigel混匀，均匀铺在 96 孔板底面，每孔 50 μL,避免气泡，所有操作均在冰上进行； 完成后置培养板于37℃ 培养箱，30 ~ 60 min,使 Matrigel 凝固； 消化收集细胞，用无血清培养基 HE-SFM 洗细胞 3 次； 重悬于无血清培养基 HE-SFM 中，细胞计数； 调整细胞密度至 60 000 个/mL,每孔接种 100 μL; 置 37℃培养箱培养，6 h 后观察，拍照； 图片用 Image-Pro Plus 6. 0软件分析，统计管腔长度。
　　
　　1. 9 统计学分析
　　
　　实验数据均以平均值 ± 标准差（ Mean ± SD）形式表示，每组实验独立重复 3 次。 数据处理采用Graph Prism 5 软件进行。 两组间数据比较采用的 t检验分析（ t tests and nonparametric tests） ,多组比较用单因素方差分析，P <0. 05 则具有统计学意义。
　　
　　2 结果
　　
　　2. 1 靶向 ANG 的 miRNA 的预测
　　
　　根据文献报道，选择较为常用的数据库对靶向 ANG-3'UTR（ 3'untranslated region） 的 miRNA 进行预测，包括 TargetScan、miRNA. org 和 MicroCosm（ 具体网址见 Table 2） . 通过预测，3 个数据库分别给出 可 能 靶 向 ANG-3' UTR 的 miRNA,结 果 如Table 2 所示。
　　
　　经综合分析，本论文选择 8 个 miRNAs 进行下一步实验验证，包括 miR-1208、miR-182、miR-196b、miR-198、miR-296-5p、miR-409-3p、miR-570 和 miR-641（ 以粗斜体标示在 Table 3 中） . 该 8 个 miRNA 与ANG-3'UTR 的结合位点见 Fig. 1A 所示。
　　
　　2. 2 候选 miRNAs 的验证
　　
　　为验证这些预测得到的 8 个 miRNA 是否真正靶向 ANG-3'UTR 而调控 ANG 的表达，本文利用化学合成的 miRNA mimic 分别检测它们对 ANG 的蛋白水平和 mRNA 水平的影响，以及它们与 ANG-3'UTR序列的直接靶向关系。 结果显示，在 HUVEC中分别转染候选的 8 个 miRNA mimic 后，ANG 的蛋白表达水平受到不同程度的抑制（ Fig. 1B） ,其中miR-296、miR-409-3p 和 miR-570 对 ANG 的 mRNA水平也有抑制作用（ Fig. 1C） ; 在双荧光素酶报告基因检测系统中，miR-196b、miR-296、miR-409-3p 和miR-641 可以下调连接有 ANG-3' UTR 的报告基因萤光蛋白的表达（ Fig. 1D） ,说明 miR-196b、miR-296、miR-409-3p 和 miR-641 可以 直 接靶向结合ANG-3'UTR而抑制 ANG 的表达。 因此，我们进一步对 miR-196b、miR-296、miR-409-3p 和 miR-641 这 4个 miRNA 进行了血管生成相关的功能分析。
　　
　　2. 3 候选 miRNAs 对血管内皮细胞增殖的影响
　　
　　分离培养人脐静脉血管内皮细胞，取其中第 3-8 代的细胞用于实验。 按一定密度接种细胞于培养皿中，培养过夜； 转染 miRNA mimic、siRNA 或对照小 RNA 后，继续培养 24 h; 消化收集细胞，按照2000 细胞 / 孔密度接种于 96 孔细胞培养板中，并加入 10 ng/mL bFGF 培养。 分别在接种后的第 0、24、48 和 72 h,用 CCK-8 试剂盒检测细胞数目，进行统计分析。 结果如 Fig. 2 所示，miR-296 和 miR-409-3p能显着抑制 HUVEC 的细胞增殖，效果接近 siANG（ siANG 为针对 ANG 的 siRNA） ; miR-641 也可以抑制 HUVEC 的细胞增殖，而 miR-196b 则对 HUVEC的细胞增殖作用几乎没有影响。
　　
　　2. 4 候选 miRNAs 对血管内皮细胞管腔形成的影响
　　
　　同时，我们用 HUVEC 的管腔形成实验检测这 4个 miRNA 对血管生成过程的影响。 HUVEC 细胞在转入了不同的 miRNA mimic \siRNA 或对照小 RNA后，以 80 000 细胞/mL 的密度接种于铺有 Matrigel的培养板上，每孔接种 100 μL; 置 37℃培养箱培养，6 h 后观察并拍照，图片用 Image-Pro Plus 6. 0 软件分析，统计管腔长度。 结果如 Fig. 3 所示，miR-196b,miR-296 和 miR-409-3p 能抑制 HUVEC 的管 腔 形成，而 miR-641 则对 HUVEC 管腔形成的抑制作用不明显，其中针对 ANG 的 siRNA 对 HUVEC 的管腔形成抑制作用最明显。
　　
　　3 讨论
　　
　　通过本项研究，我们发现 miR-196b、miR-296、miR-409-3p 和 miR-641 可以直接靶向 ANG 而发挥对血管生成的调控作用。 其中，miR-409-3p 通过下调 ANG 调控肿瘤血管生成及肿瘤转移的研究结果已由本实验室报道[16]. 我们的结果显示，这些靶向ANG 的 miRNA 所表现的生物学功能是有差异的，例如 miR-196b 对 HUVEC 的细胞增殖没有影响，但可以抑制 HUVEC 的管腔形成； miR-296 和 miR-409-3p 对 HUVEC 的细胞增殖和管腔形成均有抑制作用； 而 miR-641 则只对 HUVEC 的细胞增殖有抑制作用，提示不同的 miRNA 在调控 ANG 的同时也调控了其它基因，从而影响不同的生物学过程。 因此，只有全面研究 miRNA 对 ANG 的调控，才有可能全面阐明 ANG 的生物学功能及其作用机制。
　　
　　miRNA 是通过与靶基因 mRNA 的碱基互补配对来引导其对基因的转录后调控的[17],因 此，miRNA 的“seed”序列被认为是指导沉默复合体靶向靶基因 mRNA 的关键序列。 一般地，miRNA 的“seed”序列与靶基因的 mRNA 形成 6 ~8 个碱基的完全互补配对结构。 但是“seed”与靶基因 mRNA 的结合并不一定能介导基因的抑制，该互补结合是miRNA 调控基因的重要条件但并不是充分条件，结合区域以外的序列及因素都可影响 miRNA 对靶基因的识别和调控。 同时，同一个 miRNA 不仅可以抑制靶基因 mRNA 的翻译，也可以引导 mRNA 的降解[18]. 目前认为，mRNA 是否被降解不是由 miRNA本身决定，而是取决于 miRNA-mRNA 形成的双链结构及靶基因 mRNA 的序列，包括其结合位点的数目、位置及间距、结合类型、错配的位置以及与mRNA 结 合 的 不 同 miRNPs （ a novel class ofribonucleoproteins containing numerous microRNAs ）等[19-20]. 我们的研究结果显示，有些 miRNA（ 如 miR-296、miR-409-3p 和 miR-570 ） 既 可 下 调 ANG 的mRNA 水平，也降低蛋白质表达水平； 而 miR-1208、miR-196b 和 miR-641 只下调蛋白质表达。
　　
　　需要指出的是，本研究只筛选了靶向 ANG-3'UTR 的 miRNA,没有考虑那些结合在基因编码区或5'UTR 的 miRNA.
　　
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