随着神经科学的不断发展，脑组织免疫组化技术越来越多地应用于神经学研究。由于脑组织本身具有柔软、含水量大等特点，其石蜡切片的免疫组化染色结果易出现切片染色不清楚、脱片、假阳性、假阴性等问题[1],很难得到高质量的脑组织免疫组化切片。本实验采用癫痫持续状态模型 （status epilepticus,SE），用免疫组化的方法检测海马齿状回下区编码微管相关蛋白 （DCX）阳性神经元的表达，对比脑组织冰冻切片漂片法与石蜡切片贴片法免疫组化的效果，以期更好的开展实验研究工作。
　　
　　1 对象与方法
　　
　　1.1 对象
　　
　　健康雄性昆明小鼠20只，体质量 （30±5）g,由湖北省实验动物研究中心提供；东莨菪碱、匹罗卡品由Sigma公司提供；免疫组化ABC试剂盒、DCX羊抗鼠一抗、驴血清、驴抗羊二抗由Santa cruze公司提供。
　　
　　1.2 方法

      1）模型制备腹腔注射东莨菪碱1mg/kg,30min后腹腔注射匹罗卡品280mg/kg,观察小鼠一般行为变化。按Racine的6级抽搐行为评估，表现为Ⅳ~Ⅴ级发作，且癫痫状态至少持续60min以上，即为SE模型制备成功[4].0级：无任何发作迹象；Ⅰ级：头面部抽搐；Ⅱ级：节律性点头或湿狗样抖动；Ⅲ级：双侧前肢抽搐不伴后肢站立；Ⅳ级：全身强直-阵挛发作，并后肢站立，不伴摔倒；Ⅴ级：全身强直-阵挛性发作，并后肢站立伴摔倒。
　　
　　2）样本制作与分组成功模型小鼠24h后麻醉，开胸从左心室插管至升主动脉，剪开右心耳，先快速灌注生理盐水，待流出的生理盐水灌流液澄清后，再用三通管换成由0.1M PBS配制的4%多聚甲醛200~250mL,滴注约1~1.5h.待小鼠全身固定僵硬后，断头取脑。随机分别抽取8只分为2组：A组行冰冻切片免疫组化、B组行石蜡切片免疫组化 （4只死亡舍弃）。
　　
　　3）免疫组化A组冰冻切片免疫组化漂片法：取脑后置于4%多聚甲醛4℃后固定8~10h,再将脑组织转入由0.1MPB配制的30%蔗糖溶液中，4℃放置待脑沉底后取出，切取脑视神经交叉根部与四叠体之间3~4mm的包含海马层面的脑组织，用OCT包埋液氮速冻，行冰冻切片，片厚约40μm.
　　
　　逐一切片后，依次放入装有0.1MPB的24孔板中。0.01M柠檬酸缓冲液微波修复后，采用SABC法进行免疫组织化学染色。
　　
　　B组石蜡切片免疫组化贴片法：取脑后置于4%多聚甲醛室温后固定24h后，常规石蜡脱水、包埋、切片约4μm.0.01M柠檬酸缓冲液微波修复后，采用SABC法进行免疫组织化学染色。
　　
　　1.3 统计学分析
　　
　　每张脑组织切片随机取5个视野，ImagePro Plus6.0医学图像分析系统光镜下 （×400）分析免疫组织化学切片，对海马齿状回颗粒下区DCX阳性神经元数目半定量分析，所得数据用 （x珚±s）表示，用SPSS17.0软件行方差分析和t检验。
　　
　　P<0.05为差异有统计学意义。
　　
　　2 结果
　　
　　2.1 小鼠一般行为学变化
　　
　　小鼠注射匹罗卡品后平均15min左右出现节奏性咀嚼、肢体抽搐、吐涎等表现，甚至出现强直痉挛。本实验造模过程中，小鼠癫痫大发作后死亡4只，成功造成SE模型16只。
　　
　　2.2 阳性结果大体观察
　　
　　A组冰冻切片漂片法：所有脑组织切片海马齿状回颗粒下区均可见DCX阳性神经元细胞，染色背景清晰，对比明显，但有小部分脑片染色不均，且部分脑片破损、碎烂 （图1）。
　　
　　B组石蜡切片贴片法：所有脑组织切片海马齿状回颗粒下区均可见DCX阳性神经元细胞，但脑片染色背景很深，不过基本上所有脑切片完整性保持较好 （图2）。
　　
　　2.3 海马齿状回颗粒下区DCX阳性神经元计数分析海马齿状回颗粒下区DCX阳性神经元计数：冰冻切片漂片法阳性神经元表达个数为 （10.25±2.31）个，高于石蜡切片贴片法阳性神经元表达个数 （8.13±2.03）个 （P<0.05）。
　　
　　3 讨论
　　
　　以匹罗卡品点燃大鼠癫痫模型具有同人类SE或颞叶癫痫相似发生、发展过程，如海马门区神经元的死亡、胶质细胞增生、轴突丝状芽生和突触重建等，是理想的颞叶癫痫模型，常用于探讨其机制及筛选抗癫痫药物，另外还有其它化学药物可制备癫痫动物模型如海人酸、戊四唑、青霉素等[2~5].本实验以匹罗卡品诱导建立SE模型，产生的行为表现与文献报道一致，且实验操作简单方便，成功率高。
　　
　　DCX是一种编码微管相关蛋白，可促进微管聚合并稳定其网络结构。
　　
　　DCX作为研究神经元迁移、分化、再生的标记物，通过对其表达的研究可使我们了解神经元的分化与再生情况。已有研究表明海人酸诱导的癫痫模型中，癫痫刺激后齿状回颗粒下区DCX的表达明显增加，并出现向细胞区迁移的趋势[6~8].本实验结果显示，所有SE模型小鼠脑组织切片在海马齿状回颗粒下区均可见DCX的明显表达，且冰冻切片漂片法比石蜡切片贴片法的实验效果好，染色背景清晰，对比明显。
　　
　　免疫组化常用的方法有漂片法和贴片法，但做共聚焦切片时，需要厚片一般30~50μm才能达到三维重建的效果。脑组织本身比较柔软、含水量大等特点，造成脑组织免疫组化相对其他组织比较困难。
　　
　　冰冻切片最突出的优点是能够较完好地保存细胞在固定状态的酶和抗原活性，出结果相对容易，但其缺点是不能长期存放，裱片时相当困难，脑片易皱易破。而石蜡切片虽具有组织结构保存良好、假阳性误断力减低、可永久保存的优点，但制作过程较复杂，对组织损伤较大，难以保证连续切片。免疫组化过程中可能会碰到各种问题，要分析原因，去寻找相应的解决办法。本实验在做免疫组化过程中，无论石蜡切片还是冰冻切片，都采用了微波热修复抗原，可以提高阳性检出率和阳性强度[9.另外，为了克服烂片碎片，笔者认为需要注意以下几点：
　　
　　①液氮速冻时，可以在脑组织周围包裹适量OCT胶后，再将样品连同样品托放入液氮数10s左右，这样可防止脑组织因冰冻不均而产生裂痕。
　　
　　②脑组织洗片时，不宜用移液枪正对脑片直接冲洗，或将脑片吸入移液枪，或直接接触脑片，枪头应贴壁、远离脑组织。
　　
　　③裱片时，动作要轻柔，勿直接用毛笔牵拉脑片。
　　
　　总之，匹罗卡品可成功诱导SE小鼠模型，小鼠致痫后其海马齿状回颗粒下区明显可见DCX阳性神经元的表达，其表达相对正常小鼠如何变化，有待进一步研究；通过两种方法的对比，脑组织切片免疫组化染色采用冰冻切片漂片法效果优于石蜡切片贴片法。
　　
　　[参考文献]
　　
　　[1]陈勤，周君，胡冠宇。石蜡切片免疫组化过程中存在的问题及解决办法 [J].安徽大学学报，2009,33（2）：85~88.
　　
　　[2]Kandratavicius L,Balista P A,Lopes-Aguiar C,et al.Animal models of epilepsy:use and limitations.Neuropsychiatr Dis Treat,2014,10:1693~1705.
　　
　　[3]汤丽鹏。癫痫动物模型的研究进展 [J].中山大学研究生学刊，2011,32（2）：38~44.
　　
　　[4]Mendez-Armenta M,Nava-Ruiz C,Juarez-Rebollar D,et al.Oxidative stress associated with neuronal apoptosis in experimental modelsof epilepsy[J].Oxid Med Cell Longev,2014,12:293689.
　　
　　[5]宋安军，伍国锋。青霉素腹腔注射制作大鼠癫痫模型的研究 [J].生物医学工程与临床。2015,19（1）：15~18.
　　
　　[6]Lie D C,Song H,Colamarino S A,et al.Neurogenesis in the adult brain:new strategies for central nervous system diseases.Annu RevPharmacol Toxicol,2004,44:399~421.
　　
　　[7]顾佩菲，闻华，黄文妹，等。C57/BL6癫痫小鼠海马齿状回DCX和GFAP表达的时程变化 [J].中国应用生理学杂志，2011,27（1）：11~12.
　　
　　[8]李姣，潘治斌，徐仁伵。神经前体细胞、神经元细胞、神经胶质细胞的生物标志物 [J].中国老年学杂志，2015,35（8）：2273~2280.
　　
　　[9]何丹，王杜娟，曾丽华，等。不同抗原修复方法在免疫组化染色中的应用 [J].深圳中西医结合杂志，2015,25（15）：35~36.

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