我院是一所二本综合性学院，每年需要购买甲醛液 30 箱共 40 L; 一所二级甲等县级医院病理科和手术室每年大约需要购买甲醛液体 100 箱共 50 L.甲醛具有一定的致癌性，为预防和控制甲醛所致的职业危害、保护大家赖以生存的环境，找到与其具有相同固定效果的固定液来替代传统的甲醛液是迫在眉睫的事。本研究选择了无醛 GS 固定液、环保型标本保存液和传统甲醛液 3 种液体，观察不同液体对新鲜病理标本固定、组织 HE 染色和细胞免疫组化的效果，并观察 3 种保存液固定由传统甲醛液处理 2 月的病理大体标本，同时用 3 种保存液直接保存新鲜的病理大体标本，1 年时间有何不同效果，探讨无醛 GS 格林固定液和环保型标本保存液取代甲醛固定液的可行性。
　　
　　1 材料与方法
　　
　　1. 1 标本
　　
　　收集本校附属医院之一郴州市第四人民医院病理科新鲜手术标本 7 例，其中包括乳腺癌、甲状腺瘤、急性蜂窝织炎性阑尾炎、结肠癌、子宫腺肌瘤、前列腺肥大、宫颈电切术标本 7 种组织。另收集医院病理科活检标本且经过传统甲醛液固定 2 月的病理标本 24例，包括乳腺纤维瘤 6 例，胃癌 6 例，淋巴瘤 6 例、直肠癌 6 例。
　　
　　1. 2 试剂
　　
　　环保型标本保存液，张家港华亿科教设备有限公司生产，CJM-Y001 温州医学院防霉研究所研制，专利号： ZL200710005074. 4; 无醛 GS 固定液，由哈尔滨格林标本技术开发有限公司生产，生物组织标本制备液专利号： 201110023746. 0; 甲醛试剂由张家港华亿科教设备有限公司生产； HE 染色液自配，组织切片机德国莱卡 2500 型； 癌胚抗原 CEA、增殖指数蛋白 Ki-67、肌动蛋白 Actin 即用型单克隆抗体均购自福州迈新生物技术开发有限公司。
　　
　　1. 3 常规染色及免疫组化染色
　　
　　临床送检快速冷冻切片新鲜手术标本 7 例，包括乳腺癌，甲状腺瘤、急性蜂窝织炎性阑尾炎、结肠癌、子宫腺肌瘤、前列腺肥大、宫颈电切术 7 种活检组织。
　　
　　待快速冰冻诊断报告发出后，将 7 种新鲜组织分成 3等份 3 组，分别是 10% 甲醛液组、环保型标本保存液组、无醛 GS 固定液组，固定相同时间 48 h,每组同一组织各取 2 块，放入 75%乙醇+4% 甲醛液Ⅰ、Ⅱ分别固定 2 h,80% 乙醇脱水 1 h,95% 乙醇Ⅰ1 h,95% 乙醇Ⅱ1 h,无水乙醇1 h,无水乙醇Ⅱ1 h,二甲苯Ⅰ透明1. 0 h,二甲苯Ⅱ透明 1. 0 h,浸蜡液Ⅰ、Ⅱ、III 各 1. 0h; 常规石蜡包埋切片 HE 染色： 组织取材后，经脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、烤片、染色、封片等一系列过程； 同时 3 组 21 块组织石蜡，进行免疫组化染色 SP法检测 CEA、Ki-67 抗原和肌动蛋白 Actin,DAB 染色，苏木精复染： 所有石蜡切片脱蜡水洗，抗原修复，加过氧化物酶阻断试剂，室温下孵育 10 min,PBS 水洗 3×3 min,除去 PBS,切片中加正常非免疫血清室温下孵育10 min,除去血清，滴上 TMSG-1 抗体，室温下孵育 60 min,PBS 水洗 3×3 min,除去 PBS,切片上滴多聚酶结合物，室温下孵育 10 min,PBS 水洗 3 ×3min,除去 PBS,DAB 显色，自来水终上显色，苏木素复染，PBS 返蓝，梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固。同时设阴性对照，一抗用 PBS 替代。结果判断： 免疫组织化学和免疫细胞化学阳性判断标准： 以细胞质或细胞核棕黄色颗粒为阳性。每例随机计数 5 个高倍视野，根据阳性细胞数和着色强度计分： 阳性细胞数≤10% 为 0 分，>10% 且≤25% 为 1分，>25%且≤50% 为 2 分，>50% 为 3 分。按着色强度计分： 不着色0 分，淡着色1 分，黄色2 分，棕黄色3分。综合评分两者相加≥2 分者均为阳性表达。观察 3 组新鲜大体标本处理 48 h 后组织 HE 制片效果和组织抗原性保存有何异同。
　　
　　1. 4 标本放入 3 种固定液保存中
　　
　　将取材后 3 组新鲜组织，依旧放入原来液体组中保存，每个标本陈列缸的液平面高于标本 3 ~ 5 cm,沿着标本缸口四周推注一层三氯甲烷封好缸盖，注明保存标本液体名称和制作时间，过程中不加液体，时间 1 年。另收集医院病理科活检标本 24 例，包括乳腺纤维瘤 6 例，胃癌 6 例，淋巴瘤 6 例、直肠癌 6 例，待常规石蜡切片诊断报告后，依旧用 10% 甲醛液处理标本 2 月，用纯净水洗净甲醛液晾干（ 因自来水有沉淀物，使保存液不清） ,分 3 组，分别放入无醛 GS固定液标本陈列缸、环保型标本保存液标本陈列缸及传统 10%甲醛液标本陈列缸，时间 1 年，观察 3 种固定液对 7 例新鲜标本和经传统甲醛处理过的 24 例标本的固定效果有何不同。
　　
　　2 结果
　　
　　2. 1 HE 染色
　　
　　使用无醛 GS 固定液制备的组织蜡块，在切片中感觉组织软硬适中，尤其是处理子宫肌瘤组织，没有过硬现象，切片厚薄均匀，连续性好，常规 HE 染色组织结构清楚，细胞形态完整，核质比清晰，无醛 GS 固定液在保持组织形态学与传统固定液相比无明显差异，色比度适宜（ 图 1A-B） .而环保型标本保存液处理组织后染色效果差一些，其染色细胞膜分界不太清楚，胞质和胞核着色欠鲜艳、组织显得松散（ 图 1C） .
　　
　　2. 2 免疫表型
　　
　　采用无醛 GS 固定液处理标本制备的组织石蜡切片，经免疫组化 SP 法染色显示胞质胞核内抗原性保存好，阳性结果定位准确，背景清晰，与传统组织染色效果无明显差异，组织固定 48 h 免疫组化效果一致，胞质着色（ 图 2A-B） ,胞核着色（ 图 2D-E） .而环保型标本保存液处理标本的组织免疫组化 SP 法CEA、CK7 和 Actin 表达不佳（ 图 2C、F） ,本该胞质或胞核着色，结果是胞质着色颜色浅淡，达不到阳性标准，细胞核着色阴性。
　　
　　2. 3 3 种固定液固定大体标本 1 年效果比较
　　
　　1 年后开盖检查，3 种液体的量及色质情况： 陈列标本缸内液体量均下降，环保型标本保存液、无醛 GS固定液及 10% 甲醛液液面分别下降了 2. 1 cm、1. 1cm 及 1. 2 cm.新鲜标本的环保型标本保存液组，液体浑浊并开始变黄，标本柔软度较明显，新鲜标本无醛 GS 固定液组液体清晰透亮，而 10% 甲醛液组色质纯清无变化（ 表 1） .
　　
　　经过10%甲醛液固定2 月后的标本，放入3 种液体陈列标本缸，1 年后开盖检查，环保标本保存液组液体淡褐色透明，标本自然正常，未见霉变，质地中等，无醛 GS 固定液组液体淡黄清晰透亮，10% 甲醛组液色质纯清无变化（ 表 1） .
　　
　　3 讨论
　　
　　随着分子生物学的快速发展和对医学实验室环境评价标准的逐步提高，使用环保试剂、创建“绿色”实验室已是大势所趋，研发替代甲醛等有害试剂也是病理工作者多年的愿望。在国外发达国家，已经推广应用环保型的固定液取代甲醛固定液[2],在我国环保型固定液尚未得到广泛应用，目前绝大部分病理科仍然应用甲醛作为日常工作中的固定液[3-7].本研究结果显示，GS 无醛固定液能够较好地保存组织细胞的形态结构，各种病理组织使用它制备的组织切片HE 染色效果良好，所制切片符合病理诊断需求。采用 GS 无醛固定液固定的不同组织所制作的免疫组化染色结果显示，组织细胞内的抗原成分保存良好，阳性定位准确，背景清晰，与传统甲醛固定的组织所制作的石蜡切片免疫组化染色效果基本相同。无醛固定液与常规 10%中性甲醛固定液在 HE 染色、免疫组化染色病理科日常工作中，均有相同的效果，可以取代甲醛成为医院病理科和医学院校常规固定液。
　　
　　本实验研究对环保型标本保存液的固定组织效果进行评估，结果表明： 环保型标本保存液的挥发度大于福尔马林，更换周期较短，1 年时间标本液体表面易发生霉斑变，缸内液体不透明、乳白发霉浑浊、可见度不好； 与传统保存液甲醛液相比，组织固定进行常规染色，组织松散，细胞核胞质着色不鲜艳，且组织免疫组化染色效果不佳。但无醛 GS 固定液 4. 5 L/桶，每桶约 0. 3 万元，我校医学院校实验室每年消耗固定液约 40 L,支出高达 12 万，郴州第四人民医院每年固定液 50 L,耗费 15 万，与传统方法相比，试剂价格相对偏高，推广起来困难。所以同时我们选择价格比无醛GS 格林固定液便宜又无毒的环保型标本保存液进行研究，环保型标本保存液的主要成分： 壳聚糖、双乙酸盐、Na2EDTA、氯化钠、甘油，此保存液具有安全无毒、具有无刺激性气味、无腐蚀性、吸水保湿[8].
　　
　　综上所述，GS 无醛固定液能够良好地保存组织细胞的形态结构，各种病理标本使用 GS 无醛固定液制备的组织切片 HE 染色效果良好，同一标本在相同免疫组化条件下，免疫组化染色结果在抗体表达阳性率和阳性程度上，与传统甲醛固定制备的组织切片基本一致，它可以替代传统甲醛作为医学院校病理研究所和医院病理科的常规组织固定液使用[9-12].环保型标本保存液并不适合标本的长期保存和用作固定标本组织病理切片，但将病理标本用 10% 甲醛液处理 2 月后，再放入环保型标本保存液中 1 年时间，标本外观色泽正常，组织质地中等，具有了良好的弹性和韧性，保存液依然清澈透明，无浑浊现象，表面无霉点发生，标本陈列室空气无味的优点也相当明显。把标本放入保存液之前，先要用甲醛液固定好标本，这样，环保型标本保存液也可替换甲醛液保存标本，用于医学院校学院病理学大体标本制作上。环保型标本保存液具有安全无毒、价格低等优点，推广使用起来比较容易。GS 无醛固定液、新型无味标本保存液中不含任何易挥发有毒有害物质，可有效地消除甲醛强烈的刺激性气味，避免甲醛的毒害作用，改善科研人员的工作环境，从根本上解决甲醛对人体的危害及对环境污染等问题，也能够满足教学和科研的需要。
　　
　　参考文献：
　　
　　[1]Cogliano VJ,Grosse Y,Baan RA,et al. Meeting report: sum-mary of IARC monographs on formaldehyde,2 - butoxyetha-nol,and 1-tert-butoxy-2-propanol[J]. Environ Health Per-spect,2005,113（ 9） : 1205-1208.
　　
　　[2]Jones ML. How formalin affects the outcome of routine andspecial stains[J]. Biotech Histochem,2007,82 （ 3 ） : 155 -159.
　　
　　[3]Moelans CB,ter Hoeve N,van Ginkel JW,et al. Formalde-hyde substitute fixalives. Analysis of macroscopy,morphologicanalysis,and immunohistochemical analysis[J]. Am J ClinPathol,2011,136（ 4） : 548-556.
　　
　　[4]Iesurum A,Balbi T,Vasapollo D,et al. Microwave processingand ethanol- based fixation in forensic pathology[J]. Am JForensic Med Pathol,2006,27（ 127） : 178-182.
　　
　　[5]Acton A,Harvey T,Grow MW. An examination of non-forma-linbased fixation methods for xenopus embryos[J]. DevDyn,2005,233（ 147） : 1464-1469.

 

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