关键词：脑组织; 石蜡切片; 免疫组织化学;

　　脑组织由神经元和胶质细胞组成, 具有含水和脂质丰富、韧性低、极易自溶等特点。在日常免疫组化检测过程中, 脑组织样本极易出现破片、脱片以及背景染色、染色不均等现象, 严重影响了实验操作的进行与染色结果的判读。因此, 优化脑组织的处理以及免疫组化过程的相关细节具有十分重要的意义, 包括取材、固定、脱脂、脱水, 切片过程中的细节优化, 免疫组化过程的优化等。本实验室经过反复探索, 注重操作细节, 可以有效地防止脑组织在制片、免疫组化等过程出现脱片、背景染色及染色不均等现象, 现将体会总结如下。

　　1 防止脑组织切片破片、脱片

　　由于脑组织样本固定不佳、脱水、脱脂不彻底、组织切片未经过充分自然晾片而直接烤片, 以及免疫组化玻片防脱效果不佳、抗原修复、冲洗等引起了破片、脱片 (图1, 2) 。为了避免以上现象的发生, 必须严格规范组织的前期处理, 规范组织切片过程中的细节以及免疫组化的操作过程。

　　1.1 组织的前期处理

　　(1) 组织固定:在临床病理实验室的日常工作中, 造成免疫组织化学染色结果不良或失败的大部分原因, 是组织细胞没有得到及时的固定。标准化固定基本包含:使用标准的固定液、及时固定、严格固定时间。将送检的脑组织病例按照规范取材, 及时固定于4%的中性缓冲甲醛液24 h后, 沥干, 进入脱脂程序。 (2) 组织脱脂:脑实质标本富含脂质, 主要成分是卵磷脂, 所以必须脱脂, 放入三氯甲烷与丙酮 (1∶1) 脱脂24 h后, 沥干, 进入脱水程序。 (3) 组织脱水:脱水是脑组织制片的最关键步骤之一[1], 脱水不佳将容易造成后续制片的失败。采用75%乙醇脱水24 h, 与常规标本上机脱水、透明、浸蜡、包埋。

　　1.2 制片中的关键注意事项

　　制片步骤也是防止脱片最关键步骤之一[2,3,4]。脑实质标本无胶原纤维等结缔组织成分, 组织背景主要为神经元和胶质细胞突起相互交织而成, 易断裂破碎, 如切片后直接烤片, 组织与载玻片之间易形成气泡, 造成贴片不牢固, 容易掉片, 通过充分自然晾干后再烤片可以有效地防止 (图3, 4) 。组织切片厚度6μm, 摊片水温45℃, 摊片后待组织上蜡褶展平。贴片时玻片倾斜入水, 垂直捞起, 速度宜慢, 有助于沥下水份并减少气泡贴附。将贴附好的切片倾斜放于切片板, 放于室温、37℃恒温箱或者暖调下方, 务必等待水份沥干, 大约需要1~2 h, 将切片放在60℃烤片机, 烤片5 min, 石蜡熔解, 有利于贴附更牢, 然后转移60℃恒温箱烤片。

　　1.3 免疫组化过程中的注意事项

　　(1) 玻片的选择:脑组织结构中含脂质成分较多, 富含水份, 组织与玻片的粘附性差, 所以必须选择亲水性带正电荷粘附性好的防脱玻片[5]。 (2) 脱蜡:脱蜡过程也会引起脱片, 其主要原因是组织的前期处理不规范造成。解决办法同组织的前期处理基本要求。 (3) 抗原修复:抗原修复也是造成脱片、破片的原因之一, 如果采用热诱导修复可以将切片架外围包裹一层纱布, 防止因修复液的加热沸腾直接冲击组织而导致脱片、破片, 也可以采用热孵育法。 (4) 冲洗:手工免疫组化过程每步骤都需要TBS冲洗, 避免直接对着组织冲洗, 过度的冲洗也可以导致脱片、破片。

　　2 防止背景染色

　　脑组织免疫组化会产生非特异性背景染色, 主要原因是内源性过氧化物酶、疏水性及离子相互作用、内源性生物素、抗体浓度过浓造成[6,7]。

　　2.1 内源性过氧化物酶

　　同样能够催化底物, 脱氢、氧化形成DAB棕色, 形成不溶于水及有机溶剂的棕色颗粒, 引起非特异性染色。消除方法:3%H2O2或者3%H2O2甲醇溶液孵育10 min, 以消除内源性过氧化物酶。

　　2.2 疏水性相互作用

　　疏水性相互作用是氨基酸交联产生的结果, 可以发生在邻近的蛋白分子之间或分子内部。通过醛固定可使蛋白产生疏水性。疏水性相互作用引起的背景染色, 可以通过在缓冲液中添加阻断蛋白、1%小牛血清、酪蛋白、去垢剂, 或添加高盐溶液、2.5%的氯化钠溶液, 去缓冲而使背景降低[6]。

　　2.3 内源性生物素

　　生物素是一种辅酶, 是在脱羧基酶、羧基转换酶等催化的代谢环节中所产生的羧基中间载体。脑组织中含有内源性生物素, 可使用30%蛋清水溶液阻断15 min或商品化的生物素阻断剂, 或者在滴加一抗之前用10%正常的羊血清、非免疫动物血清、产生二抗 (桥抗) 的动物种属的非免疫血清阻断[8]。

　　2.4 抗体质量

　　抗体的质量不纯和浓度过浓也可导致背景染色, 针对这个问题可以通过更换抗体克隆号、稀释一抗、采用能减少背景染色的抗体稀释液稀释一抗[7]。
 

　　图1脑组织未规范处理HE染色, 中央破片、脱片图2脑组织未规范处理免疫组化染色, 中央完全脱片, 但是对照片却完好无损图3脑组织规范处理后HE染色完好图4脑组织规范处理后, 免疫组化染色 (GFAP, En Vision二步法, DAB显色) 未出现破片、脱片

　　3 防止染色不均匀

　　脑组织切片免疫组化染色出现染色不均现象, 主要是由于脑组织样本在前期的处理不佳、切片太薄、气泡产生、染色过程轻微的漂片、防脱玻片选择不对等原因引起的。 (1) 脑组织样本的前期处理:脑组织固定不佳、脱水、脱脂不好, 免疫组化染色结果会出现染色不均匀现象。解决办法同前。 (2) 切片厚度:脑组织切片太薄 (3~4μm) , 将会导致免疫组化染色结果太淡, 影响结果判读。切片厚度要求达到6μm。 (3) 气泡产生:裱片时水未排尽, 在局部形成气泡使组织突起, 染色时, 试剂渗入后不易洗净, 显色过深所致。贴片时玻片倾斜入水, 垂直捞起, 速度宜慢, 有助于沥下水份并减少气泡贴附, 充分晾片。 (4) 轻微漂片:脑组织切片经过抗原修复后, 出现了轻微的漂片后, 抗体渗入后不易清洗, 导致染色不均匀。 (5) 防脱玻片:部分全自动免疫组化染色仪采用漩涡式混匀及动力学驱动技术来达到抗原抗体结合的目的, 选择亲水性的防脱玻片非常重要, 否则会出现染色结果阴阳脸、阴性、染色不均匀现象。

　　要想得到一张理想的脑组织石蜡切片, 并通过免疫组化染色达到清晰的特异性蛋白表达。必须优化组织的前期处理, 包括:组织的固定、脱脂、脱水、石蜡切片厚度、晾片、烤片以及免疫组化过程中的每一个细节, 把握住关键性的要点, 即可以较好解决脑组织免疫组化染色中出现的问题, 提高免疫组化染色质量。

　　参考文献

　　[1]郭林芝, 李灵敏.大鼠脑组织石蜡切片免疫组化的体会[J].山西医科大学学报, 2013, 44 (4) :311-312, 328.
　　[2]荣玮, 董海影, 帅智峰, 等.脑组织石蜡切片制作体会及问题分析[J].解剖学杂志, 2016, 39 (6) :753-754.
　　[3]褚迎欣, 张树波, 高晓增, 等.高质量大鼠脑组织连续石蜡切片的制作方法[J].第二军医大学学报, 2016, 37 (4) :527-528, 封3.
　　[4]Zhang J, Xiong H.Brain Tissue Preparation, Sectioning, and staining.In Current Laboratory Methods in Neuroscience Research Springer New York[M], 2014:3-30.
　　[5]夏明汗, 潘晓婷.脑组织切片免疫组化技术中防止脱片制作方法[J].细胞与分子免疫学杂志, 2010, 26 (2) :187.
　　[6]John D, Bancroft, Marilyn Gamble.着, 周小鸽, 刘勇译.组织学技术的理论与实践[M].北京:北京大学医学出版社, 2010:391-392.
　　[7]陈余朋, 张声, 王行富, 等.乳腺癌HER-2免疫组化染色和判读存在的问题与对策[J].临床与实验病理学杂志, 2016, 32 (4) :461-464.
　　[8]Gretchen H.Delcambre, Junjie Liu, Jenna Ma.Herrington, et al.Immunohistochemistry for the detection of neural and inflammatory cells in equine brain tissue[J].Peer J, 2016.4:e1601.

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