遗传病论文第四篇

　　题目：探讨男性染色体结构与数目异常

　　摘 要：目的 探讨染色体结构与数目异常, 以及Y染色体无精子因子AZF微缺失和AZFc区部分缺失与男性不育的关系。方法 运用多重PCR检测技术对494例无精子症、严重少精子症、少精子症患者和236例精液正常已生育男性进行AZF微缺失和AZFc部分缺失检测, 并对494例男性不育患者进行外周血染色体核型分析。结果 在无精子症、严重少精子症和少精子症患者中染色体数目与结构异常的发生率分别为11.86% (21/177) 、3.39% (6/177) 、2.08% (3/144) 。无精子症和严重少精子症患者Y染色体AZF微缺失率明显高于少精子症组, 差别有统计学意义 (P<0.05) 。生精障碍组和严重少精子症组与正常对照组b2/b3缺失率差异均有统计学意义, 而在各组间gr/gr缺失显示相似的频率。结论 无精子症、严重少精子症和少精子症患者中存在较高频率的染色体结构、数目异常与AZF基因微缺失现象, 提示染色体结构、数目异常与AZF基因微缺失可能是男性不育的重要遗传原因;Y染色体AZFc区存在多种部分缺失类型, gr/gr缺失可能对生精功能的影响较小, 仅是一种基因组多态, b2/b3缺失是男性生精障碍的的风险因素。

　　关键词：染色体异常; AZF微缺失; AZFc区; 男性不育;

　　Study of the genetic etiology of male infertility

　　WANG Tian-yuan XIAO Xiao-su ZHENG-Bao HAO Ya-jun LIU Shi-shi

　　Dept.of Clinical Laboratory, Nanshan District People′s Hospital Genetic Definition Clinic, Shenzhen Hospital of Peking University

　　Abstract：

　　Objective:To investigate the correlation of male infertility with abnormality of chromosomal construction and quantity and with the microdeletion of azoospermia factor (AZF) gene on the Y chromosome. As well as the relationship between the partial deletions in the AZFc region of Y chromosome and male infertility. Methods:Multiplex-PCR technique was used to detect microdeletions of AZF gene in 494 infertile men and 236 fertile controls with fifteen sequence-tagged sites (STSs) . Chromosome karyotype analyses were performed in the 494 patients. Results:In the azoospermia, severe oligozoospermia and oligozoospermia patients, the incidences of chromosomal abnormality were 11.86% (21/177) 、3.39% (6/177) 、2.08% (3/144) .The rates of AZF microdeletion in azoospermia and severe oligozoospermia were significant higher than that of the oligozoospermia. there were significant differences in the b2/b3 deletion between patients with spermatogenic failure and serious oligozoospermia and controls (both P<0.05) . However, there was no difference for the gr/gr deletion between patients and controls. Conclusion:There was a high frequency of chromosomal construction and quantity abnormality and microdeletion of AZF gene in patients with azoospermia, severe oligospermia and oligospermia, which suggested that chromosomal abnormality and microdeletion of AZF gene might be the important genetic causes of male infertility;There are several types of partial deletion in the AZFc region on Y chromosome, gr/gr deletion might slightly affect male spermatogenesis and exist as a kind of genomic polymorphism. b2/b3 deletion is the high risk factor to spermatogenic failure of male infertility.

　　Keyword：

　　Chromosomal abnormality; AZF microdeletion; AZFc region; Male infertility;

　　Received： 2017-10-20

　　不孕不育症是一类严重危害人类身心将健康的疾病, 其发生占育龄夫妇的10%左右, 其中男性因素导致不孕不育的占50%。男性不育的病因复杂, 主要表现为生精障碍所致的无精子症、严重少精子症和少精子症。目前大量研究认为许多因素与男性不育相关, 如性腺功能低下、精索静脉曲张、生殖泌尿道感染、输精管梗阻、隐睾、获得性睾丸炎等。由于遗传缺陷包括染色体异常和基因突变所引起的精子发生障碍约占男性不育的30%以上[1]。本实验通过较大样本量的病例对照研究 (177例无精子症患者, 177例严重少精子症患者, 140例少精子症患者和236例精液正常已生育男性) , 探讨染色体结构与数目异常, 以及Y染色体无精子因子 (azoospermia factor, AZF) 微缺失和AZFc区部分缺失与男性不育的关系。

　　1 对象与方法

　　1.1 研究对象

　　2015年1月至2017年7月在我院遗传咨询门诊、生殖中心、泌尿外科等就诊的男性不育患者 (其中无精子症177例, 严重少精子症177例, 少精子症140例) , 年龄19-44岁, 平均年龄 (28.7±3.5) 岁。所有男性不育患者均无生育史, 通过相关的临床和实验室检查, 排除了梗阻性无精、逆行性射精、泌尿生殖道感染、隐睾、精索静脉曲张等因素引起的不育。根据WHO推荐的精液检验标准[23], 连续三次进行精液分析, 3次精液离心后, 沉淀涂片均未见精子者为无精子症;平均精子密度<5×106/L者为严重少精子症;平均精子密度介于5-20×106/L者为少精子症。236例精液正常已生育男性 (平均精子密度>20×106/m L) 和1例女性作为对照。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞遗传学检查

　　进行常规外周血淋巴细胞培养, 收集细胞沉淀, 低渗固定并制片, Giemsa染色后用显微镜观察, 每例计数30个分散良好的中期分裂相, 分析3~5个染色体核型。

　　1.2.2 外周血基因组DNA提取:

　　用亚能 (深圳) 生物技术有限公司全血DNA快速提取试剂盒提取。

　　1.2.3 Y染色体AZF微缺失检测:

　　使用深圳亚能Y染色体AZF微缺失检测试剂盒经多重PCR技术对Y染色体AZFa区:s Y82、s Y84、s Y86;AZFb区:s Y124、s Y127、s Y128、s Y133、s Y134、s Y143;AZFc区:s Y239、s Y242、s Y254、s Y255;AZFd区:s Y145、s Y152共15个微缺失位点进行扩增。PCR检测参考文献[2]。

　　1.2.4 AZFC区部分缺失的检测:

　　对未发生AZF基因微缺失的453例无精子症、严重少精子症、少精子症患者 (无精子症158例, 严重少精子症160例, 少精子症135例) 及对照组236名精液正常已生育男性行AZFc区及其附近的s Y1201 (677bp) 、s Y1206 (394bp) 、s Y142 (196bp) 、s Y1258 (968bp) 、s Y1197 (453bp) 、s Y1291 (527bp) 、s Y1191 (385bp) 、s Y1161 (330bp) 8个序列标签位点 (sequence-tagged site, STSs) 进行部分缺失检测, PCR检测参考文献[3]。

　　1.2.5 PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测及显像:

　　配制2%的琼脂糖凝胶, 溴乙锭显色, 用Dolphin-Doc凝胶成像系统进行DNA电泳条带的观察。待测标本仅缺失s Y1291, 而其余七个位点存在, 疑似gr/gr缺失;待测标本仅缺失s Y1191, 而其余七个位点存在, 疑似b2/b3缺失;待测标本同时缺失s Y1291、s Y1191和s Y1161, 其余五个位点存在疑似b1/b3缺失。为防止多重PCR出现假阴性结果, 多重PCR未能扩增出目的条带的标本 (发生缺失的标本) 用单重PCR扩增, 且所有STSs位点扩增为阴性的结果都经过3次以上的验证。

　　1.3 统计学处理

　　采用SPSS 16.0统计软件进行数据处理, 对无精子症组、少精子症组和严重少精子症组之间的AZF基因微缺失数据比较用χ2检验;对生精障碍组和正常生精组及生精障碍组间gr/gr、b2/b3缺失率比较, 用χ2检验和Fisher精确概率法 (P<0.05表示差异有统计学意义) 。

　　2 结果

　　2.1 染色体数目与结构异常情况

　　在494例生精障碍患者中, 共发现30例患者存在染色体结构和数目的异常, 其发生率为6.07% (30/494) , 其中无精子症、严重少精子症和少精子症患者的发生率分别为11.86% (21/494) 、1.69% (3/494) 、4.29% (6/494) 。在异常染色体核型中, 有13 (13/30, 43.33%) 例发生染色体数目异常, 均为先天性睾丸发育不全的患者, 临床表现为无精子症。有17 (17/30, 56.67%) 例发生染色体结构异常, 包括染色体臂间倒位、缺失及易位类型。涉及1、4、6、7、8、9、10、13、14、15、21和Y染色体 (表1) 。

　　表1 494例男性不育患者中异常染色体核型分析    

　　2.2 Y染色体AZF基因微缺失情况

　　在对照组未发现AZF微缺失, 在494例患者中检测出41例AZF微缺失 (41/494, 8.30%) , 其中无精子症患者缺失19例 (19/177, 10.73%) , 严重少精子症患者缺失17例 (17/177, 9.60%) , 少精子症患者缺失5例 (5/140, 3.57%) (表6) 。无精子症患者与严重少精子症患者的AZF基因缺失率在统计学上无显著性差异 (χ2=0.124, P=0.725, P>0.05) , 而无精、严重少精子症患者与少精子症患者的AZF基因缺失率在统计学上均存在显著性差异 (χ2=5.732, P=0.017, P<0.05;χ2=4.406, P=0.036, P<0.05) (表2)

　　表2 494例无精、严重少精及少精子症患者AZF区微缺失检测结果    

　　a:无精子症患者与严重少精子症患者AZF基因微缺失率比较;b:无精子症患者与少精子症患者AZF基因微缺失率比较;c:严重少精子症患者与少精子症患者AZF基因微缺失率比较;b、c:P<0.05

　　2.3 AZFc区部分缺失情况

　　对AZFc区及其附近的8个STSs位点进行检测, 发现了gr/gr型和b2/b3型AZFc区部分缺失类型, 其中gr/gr型缺失在对照组、无精子症组、严重少精子症组、少精子症组及生精障碍组的缺失率分别为6.78% (16/236) 、5.06% (8/158) 、6.25% (10/160) 、5.19% (7/135) 、5.52% (25/453) ;b2/b3型缺失在对照组、无精子症组、严重少精子症组、少精子症组及生精障碍组的缺失率分别为3.81% (9/236) 、8.23% (13/158) 、9.38% (15/160) 、8.15% (11/135) 、8.61% (39/453) 。其中严重少精子症组与正常对照组、生精障碍组与正常对照组的b2/b3缺失率差异均有统计学意义 (P<0.05) , gr/gr缺失的发生率在实验组和对照组间及各实验组间相类似 (表3) 。

　　表3 AZFc区部分缺失率的χ2检验P值    

　　a:P<0.05

　　3 讨论

　　近年来, 男性生精障碍的遗传病因研究取得了较大的进展, 陆续发现了一些与无精子症、严重少精子症和少精子症相关的遗传因素, 如染色体异常、Y染色体AZF微缺失、AZFc区的部分缺失及某些基因的突变等。据统计男性不育患者中染色体异常发生率为2%~5%, 染色体异常作为男性不育的一个重要病因正逐步得到承认。精子的发生受诸多有序表达的基因控制, 染色体是基因遗传物质的载体, 所以染色体结构、数目的异常或者基因缺失可影响精子的生成, 导致无精子症或少精子症。在本文494例无精子症、严重少精子症、少精子症患者中, 发现染色体异常核型30例 (6.07%) , 最常见的是先天性睾丸发育不全的患者, 占异常核型的43.33% (13/30) , 其临床症状表现为无精子症。其发生机制可能是由于多余的一条X染色体产生剂量效应而使生精细胞损伤, 影响精子生成[4]。染色体结构异常也是导致精子生成障碍的基本原因, 包括常染色体及性染色体的易位和倒位。据估计有2000个基因调节精子的生成, 其绝大部分位于常染色体上, 但也有约30个基因位于Y染色体上, 包括位于Y染色体长臂上的精子生成基因。常染色体上调节精子生成的基因参与精子发生过程及体内其它细胞的新陈代谢的调节, 而Y染色体的基因则不参与生殖以外的生理功能调节。由于常染色体之间发生了易位和倒位, 破坏了该区域结构的完整性, 导致调节精子生成的基因不能正常发挥作用, 造成无精子症或少精子症而导致不育[5]。

　　在分子遗传学层面, 1976年, Tiepolo等提出多因子参与生精过程, 并第1次将AZF定位于Yq11.22-11.23区域, 并于1996年进一步将AZF区域划分为3个互不重叠的区域:AZFa, AZFb和AZFc区。Y染色体微缺失同精子生成减少的因果关系在临床上已经得到证实[6]。2004年EAA/EMQN推荐了一组设计较好的STS位点用于Y染色体微缺失的监测, 并建议在临床上推广应用[7]。目前, 针对AZF区微缺失的研究很多, 但在不同的资料中有报道较大差异。在本研究中无精子症患者缺失率为10.7%, 严重少精子症患者缺失率为9.6%, 同国外的某些报道不同, 这可能与研究对象选择的标准不同、检测所用的STSs标记位点的密度和位置不同、检测方法不同以及研究群体的遗传背景和环境不同等有关。同Y染色体微缺失相比, AZFc区部分缺失同精子发生之间的关系则比较复杂。研究发现AZFc区的部分缺失率远高于AZFa区和AZFb区。Az Fc区因存在众多的的Amplicons, 方向一致的相同的Amplicons之间可发生同源重组, 方向相反的相同Amplicons可在发生染色体内倒位后形成新的Amplicons排列, 在其后的某一代中发生同源重组。故AZFc区同源重组导致的缺失类型的种类是多种多样的, 在本研究中, 我们发现了gr/gr、b2/b3、b1/b3等类型的缺失, 其中gr/gr缺失在AZFc区部分缺失中发生率最高, 在实验组为5.52%, 在对照组为6.78%, 未发现gr/gr缺失的发生率在实验组和对照组之间及各实验组间存在差别, 提示该人群中gr/gr缺失似与男性不育无明显相关, 只是一种类型的基因组多态。与gr/gr缺失相比较, b2/b3缺失的发生率在生精障碍组与对照组、严重少精子症组与对照组, 均存在差别 (P<0.05) , 差别有统计学意义, 提示该缺失与男性不育可能有一定的相关性。

　　由于男性不育患者病因不清, 对多数病例缺乏特异有效的治疗方法, 通过AZF微缺失和AZFc部分缺失检测, 可以使这些男性不育患者明确病因, 找到精子生成障碍的真正原因, 提供更加明确的遗传学诊断, 避免一些不必要的药物及手术“治疗”。目前已有研究证实AZFc区缺失及部分缺失可以通过体外受精 (in vitro fertilization, IVF) 及单精子胞浆内注射 (intracytoplasmic Sperm Injection, ICSI) 垂直传递给下一代男婴[8]。因此, 在行IVF或ISCI治疗之前应对男性进行AZF微缺失及AZFC区部分缺失的检查, 避免遗传缺陷的垂直传递, 为患者的诊断、治疗及遗传咨询提供理论依据并达到为临床服务的目的。

　　参考文献
　　[1]Chang PL.Y chromosome microdeletion in a father and his four infertile sons[J].Hum Reprod, 1999, 14 (11) :2689-2694.
　　[2]肖晓素, 等.无精子症及严重少精子症患者Y染色体AZF微缺失及点突变的研究[J].中国优生与遗传杂志, 2008, 16 (10) :13-15.
　　[3]肖晓素.江利青, 王田园.无精子因子c区部分缺失与男性不育相关性研究[J].中华医学遗传学杂志, 2010, 27 (3) :294-298.
　　[4]刘秀忠, 苏维, 郑继成.Klinefelter综合征的临床与细胞学分析[J].中外医学研究, 2009, 7 (5) :91.
　　[5]肖晓素, 刘晓翌, 王勇强, 等.男性不育患者的细胞遗传学和分子遗传学研究[J].中国优生与遗传杂志, 2004, 12 (3) :28-30.
　　[6]Ferlin A, Arredi B, Foresta C.Genetic causes of male infertility[J].Reprod Toxicol, 2006, 22 (2) :133-141.
　　[7]Simoni M, Bakker E.EAA/EMQN best practice guidelines for molecular diagnosis of y-chromosomal microdeletions.State of the art 2004[J].Int J Androl, 2004, 27 (4) :240-249.
　　[8]万磊, 蔡志明.AZFc部分缺失与男性不育的关系[J].中华男科学杂志, 2009, 15 (2) :165-169.

　　范文一： 遗传病论文(独家整理6篇)
　　范文二： 胚胎干细胞构建遗传疾病模型的意义探讨
　　范文三： 单基因遗传病分子诊断技术的发展研究
　　范文四： 探讨男性染色体结构与数目异常
　　范文五： 探讨基因工程治疗遗传病的发展前景

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