遗传病论文第三篇

　　题目：单基因遗传病分子诊断技术的发展研究

　　摘要：单基因遗传病 (monogenic disease) 指由单个或单对等位基因突变导致的疾病, 一般遵循孟德尔遗传规律, 传统的单基因遗传病诊断通常依赖于系谱分析、生化、影像等手段。近年来, 分子诊断技术特别是高通量测序技术已经成为单基因遗传病的主要诊断手段, 对单基因遗传病的明确诊断、预防和指导治疗发挥着越来越重要的作用。本文对40多年来单基因遗传病分子诊断技术的发展进行回顾, 介绍其最新进展, 并展望其在单基因遗传病未来的研究进展。

　　关键词：单基因遗传病; 分子诊断; 高通量测序;

　　Advances in genetic diagnosis of monogenic diseases under high-throughput sequencing

　　CAI Aojie XUE Shuwen KONG Xiangdong

　　Center of Prenatal Diagnosis, the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University

　　Abstract：

　　Monogenic diseases refer to diseases caused by a single gene or a single allele mutation that can be readily explained by mendelian inheritance. Traditional genetic diagnosis of monogenic diseases usually depends on pedigree analysis, biochemical, imaging, etc. In recent years, molecular diagnostic techniques, especially high-throughput sequencing technology, have become the primary diagnostic tool for monogenic diseases. These molecular techniques play an increasingly significant role in the diagnosis, prevention and treatment of monogenic diseases. In this review, the developments of molecular diagnostic techniques over the past 40 years in the context of monogenic diseases will be discussed, and the latest progress and its prospect on future research will be introduced.

　　Keyword：

　　Monogenic disease; Molecular diagnostics; High-throughput sequencing;

　　单基因遗传病 (monogenic disease) 指由单个或单对等位基因突变导致的疾病, 一般遵循孟德尔遗传规律。目前, 人类已知的单基因病已经超过10 000种, 尽管单个病种的发病率很低, 通常被称为罕见病, 但是因种类多, 在人群中仍有着大约1/100的总体发病率[1], 因此罕见病其实并不罕见。很长一段时间里, 受技术所限, 单基因病既不能防, 也不能治。随着分子生物学技术的发展, 越来越多的单基因病可以预防, 有的也可以治疗, 甚至基因治疗。而基因诊断或称分子诊断成为单基因遗传病防治的主要前提手段之一。

　　分子诊断是当代医学发展的重要前沿领域之一, 其核心技术是基因诊断。最早的分子诊断技术是Southern[2]于1975年发明的DNA印迹技术。1976年, 美籍华裔科学家简悦威成功应用液相DNA分子杂交技术实现了镰形细胞贫血症的基因诊断[3], 是人类遗传病诊断开始进入分子诊断时代的重要里程碑。随着高通量测序技术的发展, 适用于单基因遗传病的临床分子诊断技术得到迅速发展。本文回顾了传统的单基因遗传病基因诊断方法和以高通量测序为代表的分子诊断方法的研究进展, 以期为临床遗传病诊断工作提供一些有益的参考。

　　1 单基因遗传病分子诊断的应用

　　目前分子诊断在单基因遗传病临床工作中的主要应用包括6个方面: (1) 临床确诊诊断, 通过分子诊断鉴定或鉴别单基因病已成为临床常规工作, 最常见的是小儿内科、神经内科、内分泌科、肾病科等, 分子诊断在一定程度上已经可以取代常规的诊断, 例如脊肌萎缩症 (spinal muscular atrophy, SMA) 的基因诊断, 杜氏肌营养不良症 (Duchenne muscular dystrophy, DMD) 的基因诊断都已经成为了一线诊断。 (2) 症状前遗传学诊断, 某些遗传代谢病或迟发性遗传病如果早发现、早治疗, 对于避免致病、致残十分重要。例如肝豆状核变性 (hepatolenticular degeneration, HLD) 家庭, 患者如果早期发现并及时进行驱铜治疗则可以避免发病, 而通过分子诊断可以实现早期诊断, 有助治疗。 (3) 新生儿遗传代谢病筛查, 大多数新生儿疾病为单基因遗传病, 但这些严重遗传病的表型大多相似, 难以通过常规方法鉴定或鉴别, 通过新生儿遗传代谢病或先天性免疫缺陷症的分子诊断, 可以及时诊断遗传病, 让医生和家属少走弯路, 并且可对下次妊娠提供科学咨询。 (4) 产前诊断, 通过孕早、中期的胎儿绒毛、胎儿羊水的DNA的分子诊断, 可以明确胎儿是否为遗传病患者。 (5) 胚胎植入前遗传学诊断, 单基因遗传病家系在孕妇进行胚胎植入前, 对胚胎进行分子诊断来选择健康的胚胎进行植入, 可避免孕中期产前诊断时如确诊为患胎时所带来的治疗性流产的痛苦选择。 (6) 孕前或群体单基因遗传病筛查, 隐性遗传病具有生育突发性、隐蔽性的风险, 孕前进行夫妇双方的隐性遗传病携带者筛查, 可使隐性遗传病携带者夫妇避免生育隐性遗传病患儿。

　　2 常规单基因遗传病分子诊断技术

　　2.1 Southern印迹技术 (Southern blot)

　　Southern于1975年发明了DNA印迹技术。Southern blot是最为经典的DNA分子检测方法, 曾广泛运用于各种基因突变的检测, 包括缺失、插入、易位等, 因步骤繁琐、电离辐射等缺点逐步退出了主流的检测领域, 但其对面肩肱肌营养不良的基因诊断尚不能被替代[4], 除此之外, 近年来很少见到有其他单基因遗传病应用Southern印迹技术进行诊断的报道。

　　2.2 聚合酶链式反应 (polymerase chain reaction, PCR)

　　PCR技术由美国PE Cetus公司的Kary Mullis在1985年建立[5], 已经成为核酸分子扩增检测最常用的方法。在单基因遗传病分子诊断中, 有些基因突变如大片段缺失可直接采用PCR技术进行检测, 例如DMD基因大片段缺失的男性患者可直接经PCR扩增后采用琼脂糖电泳检测技术进行DMD的分子诊断[6]。目前PCR技术主要作为常规基因诊断的前期必要步骤, 如多重连接探针扩增技术 (multiplex ligation-dependent probe amplification, MLPA) 、Sanger测序、芯片杂交等的基础步骤, 因此PCR是许多分子诊断技术的基础方法, 目前是分子诊断实验室的主流技术之一。

　　2.3 多重连接探针扩增技术 (MLPA)

　　MLPA技术于2002年由Schouten等[7]首先报道, 是一种能够在同一反应管内检测多达50个核苷酸序列的拷贝数变化的方法。其具有特异性高、精确度高、重复性好、操作简便、高通量等优点。MLPA技术可检测出若干人类基因拷贝数的变异, 也可检出已知点突变, 现已广泛应用于存在基因缺失/重复突变、点突变的人类遗传疾病的分子诊断, 如DMD/BMD、SMA、迪格奥尔格综合征 (Di Georges syndrome) 等[8,9,10]。但MLPA对DNA浓度和纯度要求高, 只能检测基因或染色体数目的异常或已知点突变, 不能筛查未知点突变和平衡易位等, 另外MLPA技术的开展必须要求毛细管电泳设备。

　　2.4 聚合酶链反应-限制性片段长度多态性技术 (polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism, PCR-RFLP)

　　PCR-RFLP技术主要是针对PCR产物, 选择特异的限制性内切酶进行酶切, 然后采用琼脂糖电泳或聚丙烯凝胶电泳技术分离酶切片段, 目前临床上主要用于具有突变热点的基因检测, 如SMA致病基因SMN基因的突变热点Exon7缺失的检测, FGFR3基因突变热点cll38A>G位点的突变检测等[11,12]。

　　2.5 三引物PCR (triplet repeat primed PCR, TP-PCR)

　　TP-PCR是采用一对引物和一条随机结合的中间引物共3条引物进行PCR扩增的方法。此方法常用于动态突变遗传病三核苷酸拷贝数变异的检测, TP-PCR产物经毛细管电泳检测形成范围超过一定碱基数 (例如50 CTG×3) 的连续毛刺状峰, 提示为患者。TP-PCR反应需要设计合理的中间引物, 要注意保证引物的浓度比例以及采用高特异的DNA聚合酶。目前临床上使用较多的是脆性X染色体综合征致病基因FMR1基因动态突变及强直性肌营养不良致病基因DM1基因的动态突变的检测[13,14]。

　　2.6 巢式PCR扩增技术

　　LR-PCR是指扩增长度大于5 kb片段的PCR。LR-PCR反应需要选用高保真的DNA聚合酶, 这类酶除了具有高保真性, 同时具有优良的延伸性和高效的扩增效率。巢式PCR是以前次PCR产物为模板, 设计引物扩增多个或单个小的PCR片断。对于存在高度同源序列的基因 (如PKD1、GBA、SMN1、CYP21A2基因) 的序列突变分析, 为了避免同源序列 (假基因) 的干扰, 通常利用基于LR-PCR的巢式PCR扩增技术。首先, 比对目标基因与同源序列, 寻找差异性位点, 设计长片段特异性引物, 确保LR-PCR扩增的特异性;其次, 以LR-PCR产物为模板, 以内部巢氏PCR引物, 采用常规PCR扩增目标基因特定目标区域。

　　2.7 倒位PCR技术 (inversion-PCR, I-PCR)

　　I-PCR是针对血友病A (hemophilia A, HA) 的一种检测技术, HA是一种X连锁隐性遗传病, 由F8基因突变导致。F8基因的Inv22和Inv1分别占重型HA的40%~50%和2%~3%[15], 对Inv22和Inv1的检测手段包括Southern blot、长片段PCR (long distance PCR, LD-PCR) 和I-PCR。目前对intron 22重组检测的常用方法主要为LD-PCR和I-PCR 2种。LD-PCR片段大于10 kb, 不能确定intron 22重组的亚型, 并且扩增片段GC含量较高, 对DNA质量和试剂要求较高, 成功率较低。I-PCR包括酶切、环化和引物扩增等3个步骤。I-PCR有产物片段大小特定、片段比较小、GC含量较低等优点, 因此能快速检测Inv22-I、Dup22和Del22的患者、携带者和正常人。

　　2.8 DNA芯片技术

　　DNA芯片原理是在固定支持物上合成大量寡核苷酸作为DNA探针与待测的核酸片段杂交, 对杂交后的信息进行分析, 从而得到靶片段的基因序列、表达情况等信息。该技术检测信息高通量, 自动化程度高, 一次可检测众多突变位点, 可用于疾病临床早期诊断和批量筛选、基因表达谱测定、多态性分析等, 但由于芯片技术只能检测已知突变位点, 随着高通量测序技术的快速进展, DNA芯片在单基因遗传病基因诊断中的应用受到了一定限制, 在国内DNA芯片的单基因病诊断应用主要为耳聋DNA芯片的检测。

　　3 以高通量测序为中心的单基因病分子诊断策略

　　3.1 Panel靶向测序

　　以Panel为基础的靶向高通量测序可分为单个基因靶向捕获高通量测序和多个基因靶向捕获高通量测序。单个基因靶向Panel高通量测序的设计理论基础是针对片段较长的基因, 如DMD基因、结节性硬化 (tuberous sclerosis complex, TSC) TSC1/2基因等的检测采用特异基因Panel检测效率远优于Sanger测序, 另外一种多基因靶向捕获Panel高通量测序是针对于遗传异质性较强的疾病, 如癫痫、痉挛性截瘫、遗传性肌病、非综合征型遗传性耳聋等疾病, 对于给定样本中的多个致病基因同时进行测序分析, 具有快速高效的特点, 但也存在一定局限性, 如随着新的致病基因的不断发现, 需要对多个基因靶向捕获高通量测序panel进行不断的更新, 但更新速度一般落后于新致病基因被发现的速度, 使得panel存在一定的滞后性。

　　3.2 全外显子组测序 (whole exome sequencing, WES)

　　WES就是利用杂交捕获技术获取、富集基因组中所有具有蛋白编码功能的外显子区域DNA序列, 并对后者进行高通量测序的分析方法。人类的全基因组中有多达180 000个外显子, 占整个基因组的1%左右[16], 通过高通量测序技术进行外显子组测序, 是发现或鉴定引起疾病的遗传变异的有效途径。

　　2009年, Ng等[16]在世界上首次证实外显子组测序在确定罕见致病基因方面具有可行性和应用价值, 并于2010年首次成功地利用WES技术鉴定了米勒综合征 (Miller syndrome) 的致病基因DHODH[17]。全外显子组测序技术所需样本数量少、通量高、耗费低, 大大推进了人类单基因遗传病的分子诊断。

　　外显子组测序能够更快地确定致病基因及突变位点[18], 有助于加速筛选发现单基因疾病、癌症等复杂疾病的致病基因和易感基因等。但是外显子组测序只能捕获集中于外显子区域的测序, 不能获得完整的基因组信息且不适用于DNA结构变异和高度同源区变异体的检测。

　　3.3 全基因组测序 (whole genome sequencing, WGS)

　　WGS是对已知标准基因组序列的个体进行全基因组的重测序。WES (外显子组测序) 对于外显子以外的区域不能有效地进行基因检测, 通过WGS可进行全基因组检测[18,19,20]。因为人类基因组过于庞大, 一次单端全基因组测序很难达到所需要的测序深度, 需要重复测序或双端测序。因此, WGS成本昂贵且由于不能达到足够的测序深度, 结果准确性会降低, 目前难以大规模应用于临床。

　　3.4 高通量测序用于单基因遗传病的局限性

　　虽然高通量测序有高通量和相对低成本的特点, 但对于单基因病基因诊断仍有其局限性, 首先是高通量测序的结果必须经过Sanger测序验证, 通常高通量测序的结果不能直接用于诊断;其次高通量测序不能解决一些特殊的单基因病基因突变的检测, 包括基因的倒位突变, 如血友病A基因有长片段倒位存在, 如SMA、肾上腺皮质发育不良、成人型多囊肾等存在假基因的疾病的基因诊断, 通过高通量测序往往不能得到满意结果;再次, 由于受种族差异、数据库及基因突变功能验证等的影响, 大量的高通量测序结果不能得到很好的解读, 也制约了高通量测序在单基因遗传病分子诊断中的应用。

　　4 以高通量测序为基础的无创产前分子诊断 (non-invasive prenatal diagnosis, NIPD)

　　4.1 胎儿游离核酸无创单基因病产前诊断

　　利用无创产前检测诊断胎儿单基因病的基本原理是在母体血浆总游离DNA (cell-free DNA, cf DNA) 中通过检测出胎儿是否携带来自父母的致病基因或致病基因突变。对于常染色体显性遗传病, 通过检测孕妇本人的血浆游离DNA是否携带致病位点 (父源突变、新发突变) 来判断胎儿是否发病, 目前应用最多的是检测软骨发育不全 (achondroplasia) [21]。对于常染色体隐性遗传病, 若父母同时携带不同的杂合突变 (先证者为复合杂合突变) , 如果在孕妇外周血中检测到父源突变, 那么胎儿有50%的发病风险, 应进一步行侵入性产前诊断明确胎儿是否患病;如未检出父源突变, 那么胎儿最多为携带者, 孕妇无需接受侵入性产前诊断, 避免了50%的孕产妇进行有创性产前诊断, 从而减少了不良妊娠结局的发生[22]。若父母携带相同致病杂合突变, 则需要通过大规模平行测序或数字PCR技术等精确定量胎儿游离DNA (cell-free fetal DNA, cff DNA) 浓度, 以此来分辨出突变来自父源或母源[23]。目前利用无创产前检测可能诊断的单基因病包括软骨发育不全、先天性肾上腺皮质增生 (congenital adrenalhyperplasia, CAH) 、DMD、枫糖尿病 (maple syrup urine disease) 、β地中海贫血 (β-mediterranean anemia) 和SMA等[21,24,25,26,27,28]。目前最新的进展是通过无创产前DNA检测解决新发突变 (de novo mutation) , 未来可以通过NIPD进行胎儿的群体筛查, 包括遗传性 (inheredited) 的突变和新发突变都可以通过该方法进行产前筛查。

　　4.2 循环胎儿细胞无创单基因病产前诊断

　　在孕早期的母血中存在微量的胎儿有核红细胞 (nucleated red blood cell, NRBC) , 因其单核、含有完整胎儿遗传信息且细胞周期短, 更适合全基因组分析, 被认为是实施NIPD较理想的靶点。但母血中的胎儿细胞非常少, 限制了其应用的发展。目前临床上研究多针对改进细胞的分离方法, 有研究成功利用基于红细胞微流控技术的富集和负向富集的两级富集法分离出循环胎儿细胞并完成性别鉴定[29]。循环胎儿细胞在无创产前检测领域具有巨大的潜能, 相信随着技术进一步的发展, 利用循环胎儿细胞进行单基因病的NIPD或将成为新的研究热点。

　　4.3 子宫颈滋养层细胞无创单基因病产前诊断

　　孕妇宫颈粘液中也存在胎儿脱落的绒毛细胞, 且数量不受胎龄、孕妇体重以及孕妇年龄的影响[30], 该发现为无创单基因病诊断提供了新的思路。有研究成功利用从宫颈脱落细胞中分离的胎儿细胞诊断地中海贫血和/或Hb S突变[31]。该技术有着良好的应用前景, 但标本母体细胞污染的问题可造成较高的假阳性率, 是目前面临的主要挑战。

　　5 小结与展望

　　分子诊断已经深入到单基因遗传病诊断、产前诊断、新生儿筛查中。以PCR、Southern杂交为主的一些经典分子诊断技术将会保留。但越来越先进和精确的分子诊断技术将会不断建立和发展, 特别是随着高通量测序的快速发展, 以高通量测序, 包括第三代测序为基础的单基因遗传病的分子诊断方法将得到更广泛的应用。除此之外, 越来越先进的分子诊断技术的建立和发展也对相关研究人员和临床医师的使用、解读和咨询提出了更高的要求。

　　参考文献
　　[1]World Health Organization.Genes and humandisease[EB/OL].http://www.who.int/genomics/public/geneticdiseases/en/index2.html.2016-08-19/2017-09-28.
　　[2]Southern EM.Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis[J].JMol Biol, 1975, 98 (3) :503-517.
　　[3]WY Kan, MS Golbus, AM Dozy, et al.Prenatal diagnosis ofα-thalassemia:clinical application of molecular hybridization[J].N Engl J Med, 1976, 295 (21) :1165-1167.
　　[4]Jones TI, Yan C, Sapp PC, et al.Identifying diagnostic DNA methylation profiles for facioscapulohumeral muscular dystrophy in blood and saliva using bisulfite sequencing[J].Clin Epigenetics, 2014, 6 (1) :23.
　　[5]Shampo MA, Kyle RA.Kary B.Mullis--Nobel Laureate for procedure to replicate DNA[J].Mayo Clin Proc, 2002, 77 (7) :606.
　　[6]李双, 白莹, 赵振华.81例假肥大型肌营养不良症患者基因突变分析[J].中华医学遗传杂志.2016, 33 (6) :762-767.
　　[7]Schouten JP, Mc Elgunn CJ, Waaijer R, et al.Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-dependent probe amplification[J].Nucleic Acids Res, 2002, 30 (12) :e57.
　　[8]Bello L, Pegoraro E.Genetic diagnosis as a tool for personalized treatment of Duchenne muscular dystrophy[J].Acta Myol, 2016, 35 (3) :122-127.
　　[9]Hwang H, Lee JH, Choi YC.Clinical characteristics of spinal muscular atrophy in korea confirmed by genetic analysis[J].Yonsei Med J, 2017, 58 (5) :1051-1054.
　　[10]Liborio S, Ivana A, Giandomenico P, et al.Use of the MLPA assay in the molecular diagnosis of gene copy number alterations in human genetic diseases[J].Int J Mol Sci, 2012, 13 (3) :3245-3276.
　　[11]van der Steege G, Grootscholten PM, van der Vlies P, et al.PCR-based DNA test to confirm clinical diagnosis of autosomal recessive spinal muscular atrophy[J].Lancet, 1995, 345 (8955) :985-986.
　　[12]Kotysova L, Mattosova S, Chandoga J.Improvement of molecular-genetic diagnostics of the most common skeletal dysplasias[J].Bratisl Lek Listy, 2015, 116 (8) :465-468.
　　[13]Rajan-Babu IS, Chong SS.Molecular correlates and recent advancements in the diagnosis and screening of FMR1-related disorders[J].Genes (Basel) , 2016, 7 (10) :E87.
　　[14]Botta A, Rossi G, Marcaurelio M, et al.Identification and characterization of 5CCG interruptions in complex DMPK expanded alleles[J].Eur J Hum Genet, 2017, 25 (2) :257-261.
　　[15]Bai N, Zhu X, Zhao Z, et al.Factor VIII mutation spectrum in haemophilia A patients in the population of Henan, China[J].Blood Coagul Fibrinolysis, 2017.[Epub ahead of print].
　　[16]Ng SB, Turner EH, Robertson PD, et al.Targeted capture and massively parallel sequencing of 12 human exomes[J].Nature, 2009, 461 (7261) :272-276.
　　[17]Ng SB, Buckingham KJ, Lee C, et al.Exome sequencing identifies the cause of a mendelian disorder[J].Nat Genet, 2010, 42 (1) :30-35.
　　[18]Choi M, Scholl UI, Ji W, et al.Genetic diagnosis by whole exome capture and massively parallel DNA sequencing[J].Proc Natl Acad Sci USA, 2009, 106 (45) :19096-19101.
　　[19]Dewey FE, Grove ME, Pan CP, et al.Clinical interpretation and implications of whole-genome sequencing[J].JAMA, 2014, 311 (10) :1035-1045.
　　[20]Lau TK, Cheung SW, Lo PSS, et al.Non-invasive prenatal testing for fetal chromosomal abnormalities by low-coverage whole-genome sequencing of maternal plasma DNA:review of 1982 consecutive cases in a single center[J].Ultrasound Obst Gyn, 2014, 43 (3) :254-264.
　　[21]Orhant L, Anselem O, Fradin M, et al.Droplet digital PCR combined with minisequencing, a new approach to analyze fetal DNA from maternal blood:application to the noninvasive prenatal diagnosis of achondroplasia[J].Prenat Diagn, 2016, 36 (5) :397-406.
　　[22]Hill M, Barrett AN, White H, et al.Uses of cell free fetal DNA in maternal circulation[J].Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol, 2012, 26 (5) :639-654.
　　[23]Everett TR, Chitty LS.Cell-free fetal DNA:the new tool in fetal medicine[J].Ultrasound Obstet Gynecol, 2015, 45 (5) :499-507.
　　[24]Kazmi D, Bailey J, Yau M, et al.New developments in prenatal diagnosis of congenital adrenal hyperplasia[J].J Steroid Biochem Mol Biol, 2016, 165:121-123.
　　[25]Parks M, Court S, Cleary S, et al.Non-invasive prenatal diagnosis of Duchenne and Becker muscular dystrophies by relative haplotype dosage[J].Prenat Diagn, 2016, 36 (4) :312-320.
　　[26]You Y, Sun Y, Li X, et al.Integration of targeted sequencing and NIPT into clinical practice in a Chinese family with maple syrup urine disease[J].Genet Med, 2014, 16 (8) :594-600.
　　[27]Ramezanzadeh M, Salehi M, Farajzadegan Z, et al.Detection of paternally inherited fetal point mutations for b-thalassemia in maternal plasma using simple fetal DNA enrichment protocol with or without whole genome amplification:an accuracy assessment[J].JMatern-Fetal Neonatal Med, 2016, 29 (16) :2645-2649.
　　[28]Parks M, Court S, Bowns B, et al.Noninvasive prenatal diagnosis of spinal muscular atrophy by relative haplotype dosage[J].Eur J Hum Genet, 2017, 25 (4) :416-422.
　　[29]Byeon Y, Ki CS, Han KH.Isolation of nucleated red blood cells in maternal blood for Non-invasive prenatal diagnosis[J].Biomedical Microdevices, 2015, 17 (6) :118.
　　[30]Fritz R, Kohanghadr HR, Sacher A, et al.Trophoblast retrieval and isolation from the cervix (TRIC) is unaffected by early gestational age or maternal obesity[J].Prenatal Diagnosis, 2016, 35 (12) :1218-1222.
　　[31]Sherlock J, Cirigliano V, Petrou M, et al.Assessment of quantitative fluorescent multiplex PCR performed on single cells[J].Annals of Human Genetics, 1998, 62 (Pt 1) :9-23.

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