羟基喜树碱（ hydroxy camptothecin,HCPT） 是从中国特有的珙桐科植物喜树中分离出的一种吲哚类生物碱，它能通过抑制拓扑异构酶Ⅰ而发挥抗肿瘤功效，为广谱抗肿瘤药物。临床上主要剂型为注射用水针剂的开环羧酸盐 HCPT,因其临床疗效低、半衰期短等缺点限制了该制剂的应用[1].所以开发新型的 HCPT 制剂具有重要的临床意义。
　　
　　甲氧基封端的聚乙二醇[methoxyl poly（ ethyleneglycol） ,MePEG]是一种性质优良的生物材料，具有生物相容性好，无毒，亲水性好，可以防止材料表面生物污染，减少蛋白质吸附和细菌黏附，而且不易被免疫体系识别等优点[2].聚乳酸-羟基乙酸共聚物[poly （ lactic-co-glycolic acid） ,PLGA]由 两 种 单体---乳酸和羟基乙酸随机聚合而成，是一种可降解的功能高分子有机化合物，具有良好的生物相容性、无毒、良好的成囊和成膜的性能，经 FDA 批准可用作注射用微胶囊、微球及埋植剂等缓释制剂的辅料和内固定装置，在生物医学领域有着广泛的应用[3].有研究表明，PLGA 作为材料制备成纳米粒可表现出较高的细胞及组织摄取率和较强的体内长循环特性[4].MePEG-PLGA 是这两者聚合而成的双嵌段聚合物，由于加入了亲水性强的 MePEG 分子，使 MePEG-PLGA 成为一端亲水另一端疏水的两性分子，能够延长所载药物在体循环中的滞留时间，且由于其粒径较小[5],可以作为较理想的两亲性长循环载药纳米制剂的载体。
　　
　　双嵌段共聚物纳米粒的制备方法有多种，其中透析法操作简单，有机溶剂用量小，可以避免使用表面活性剂，成球性好，产率高而广受应用[5].本研究以两亲性嵌段聚合物 MePEG-PLGA 为载体，羟基喜树碱（ HCPT） 为模型药物，以一种自制改良的透析法制备羟基喜树碱双嵌段共聚物纳米粒（ MePEG-PLGA-HCPT） 并对其性能表征、体外释药等方面进行考察评价。
　　
　　仪器与试药
　　
　　2996 2695 高效液相色谱仪 （ 美国 Waters 公司） ; 粉末-X'pert PRO X 射线衍射仪（ 荷兰 PANalyti-cal 公司） ; DSC 204 差示扫描量热仪（ 德国 Netzsch公司） ; DU800 紫外分光光度计（ 美国 Beckman 公司） ; FV 1000 激光共聚焦显微镜（ 日本 Olympus公司） ; JEM 2100 透射电子显微镜（ 日本 JEOL 公司） ; Nano zs 激光粒度 Zeta 电位分析仪（ 美国Malvern 公司） ; LEO 1530 场发射扫描电子显微镜（ 德国 LEO 公司） ; HZP 150 恒温振荡培养箱（ 上海精宏实验设备有限公司） .
　　
　　HCPT（ 纯度 ≥99% ,湖北李时珍医药集团，批号： 20140108） ; MePEG-PLGA（ PEG: 5000D,济南岱罡生物科技有限公司） ; 透析袋（ MWCO 3 500 ~ 14000,北京经科宏达生物有限公司） ; N,N-二甲基甲酰胺（ DMF,国药集团化学试剂有限公司） ; N,N-二甲基乙酰胺（ DMAC,广东省汕头市西陇化工厂） ; 醋酸铵（ 分析纯，国药集团化学试剂有限公司） ; 二甲基亚砜（ DMSO,广东省汕头市西陇化工厂） ; 其他试剂均为分析纯。
　　
　　方 法
　　
　　1 MePEG-PLGA-HCPT 纳米粒的制备
　　
　　采用改良的透析法，精确称取一定量 MePEG-PLGA 溶于适量有机溶剂中，室温搅拌使其完全溶解，得溶液 A; 精确称取一定量 HCPT 溶于 0. 1 mol·L- 1的 NaOH 水溶液中，得溶液 B; 将溶液 B 逐滴加入搅拌的溶液 A 中，得混合溶液 C; 将溶液 C 迅速转移至透析袋，将透析袋密封后，置于含有稀盐酸的水环境中透析。过 1 h 后将透析袋置于流动的超纯水下透析，经 10 h 透析时间后将透析袋中混悬液用1 μm 超滤膜过滤，离心，取沉淀冷冻干燥即得纳米粒。空白纳米粒子按上述方法直接将溶液 A 进行透析而得。本实验以粒径和载药量为评价标准，分别考察不同溶剂、透析袋截留相对分子质量、透析温度、透析初始含水量、透析外水相 pH、聚合物浓度、载体中的聚乙二醇（ PEG） 含量、载体中的乳酸（ LA）含量以及 HCPT 与 MePEG-PLGA 投料质量比对其指标的影响，确定优化条件。
　　
　　2 MePEG-PLGA-HCPT 纳米粒的质量评价
　　
　　2. 1 形态观察、粒径及 Zeta 电位的测定
　　
　　将 MePEG-PLGA-HCPT 纳米粒分散于适量的去离子水中，然后将混悬液滴在干净的硅片上，室温下自然干燥，真空条件下喷金 20 s,制得扫描电镜（ SEM） 样品； 将混悬液滴在300 目的铜网上，室温下自然干燥后制得透射电镜（ TEM） 样品。将 MePEG-PLGA-HCPT 纳米粒分散在去离子水中，适当超声后将其置于检测皿中进行动态光散射分析，进行粒度分析及 Zeta 电位测定。每个样品重复测试 3 次。
　　
　　2. 2 高效液相色谱法（ HPLC） 测定 HCPT
　　
　　2. 2. 1 色谱条件
　　
　　分析柱为 RP-C18（ Symmetry,250 mm × 4. 6 mm,5 μm） ; C18预柱（ 10 mm ×4.6 mm,5 μm） ; 流动相为 0. 075 mol·L- 1醋酸铵（ 冰醋酸调 pH至6.4） -乙腈（ 72∶ 28） ; 进样量为 50 μL; 流速为 0. 8mL·min- 1; 紫外检测波长为 380 nm; 温度为30 ℃。
　　
　　2. 2. 2 样品的制备 精确称取 HCPT 标准品 10 mg,置于 100 mL 棕色量瓶中，加 DMSO 稀释并定容，配制成浓度为 100 μg·L- 1的样品溶液。
　　
　　2. 2. 3 标准曲线 取上述样品溶液加色谱甲醇稀释为 100 μg·mL- 1的母液。将母液用适量 pH 3 的0. 01 mol·L- 1柠檬酸稀释得到 50,200,500,1 000,1 500,2 000,3 000 ng·mL- 1的系列浓度内酯环 HCPT标准溶液； 同样，母液用适量 pH 9 的 0. 01 mol·L- 1硼酸-色谱乙腈（ 50∶ 50） 混合液稀释得到上述同样系列浓度的羧酸盐 HCPT 标准溶液。在上述色谱条件下进样，以峰面积（ Y） 为纵坐标，HCPT 浓度（ X） 为横坐标进行线性回归。
　　
　　2. 3 MePEG-PLGA-HCPT 纳米粒载药率及包封率的测定
　　
　　精确称取 100 mg 纳米粒粉末，依 HPLC 法进行HCPT 含量测定。按下列公式计算：
　　
　　载药量/% = （ 载药微粒中 HCPT 的质量/载药微粒的质量） ×100包封率/% = （ 实际载药量/理论载药量） ×1002. 4 MePEG-PLGA-HCPT 纳米粒中 HCPT 的状态
　　
　　2. 4. 1 X-射线衍射仪分析 （ XRD） 分别将 Me-PEG-PLGA-HCPT 纳米粒、HCPT、空白 MePEG-PLGA纳米粒及 HCPT 和空白 MePEG-PLGA 纳米粒物理混合物（ 混合物的摩尔比按照载药纳米粒的载药量相应计算） 做 X 射线衍射分析。电流： 30 mA; 电压：40 kV; 扫描范围： 2θ = 5 ~ 60°； 扫描步长： 每步 0.016°； 每步时间： 10 s; 靶： 铜靶； 单色器： 石墨单色器。
　　
　　2. 4. 2 差示扫描量热仪分析（ DSC） 同上，取样品5 ~ 10 mg 置于铝盘内并密封，升温速率 10 ℃·min- 1,于氮气（ 40 mL·min- 1） 保护下测定样品的热性能，考察 HCPT 在纳米粒中的物理状态。
　　
　　2. 4. 3 激光共聚焦显微镜考察（ CLSM） 将透析
　　
　　后的混悬液滴加在干净的载玻片上并盖上盖玻片，自然干燥后用无色指甲油封片制得激光共聚焦显微镜样品。HCPT 荧光由 382 nm 的氩激光激发，样品的荧光分布由 z 轴的方向从纳米颗粒的最顶部往最底层观察，每层之间相隔 60 nm.
　　
　　3 MePEG-PLGA-HCPT 纳米粒的体外释药精确称取 MePEG-PLGA-HCPT 纳米粒粉末并装入透析袋内（ 截留相对分子质量 3 500） ,加入少量0. 1 mol·L- 1PBS（ pH 6. 8,7. 4,8. 0） ,扎紧后将其置于 100 mL PBS 缓冲液中，在（ 37 ± 0. 5） ℃，100 r·min- 1条件下恒温振荡，定时取样，并立即补加相同量的释药介质。样品用 0. 2 μm 微孔滤膜过滤后用HPLC 法测定 HCPT 的浓度，计算累积释放量。
　　
　　结 果
　　
　　1 优化制备条件
　　
　　实验确定最终优化条件为： 采用丙酮作为溶剂，透析袋截留相对分子质量为 14 000 D,透析温度为25 ℃ ,透析初始含水量 1% ,透析外水相 pH 4. 0,聚合物浓度为 3 mg·mL- 1,载体中的 PEG 含量 15%,载体中的 LA 含量为 100%,HCPT 与 MePEG-PLGA投料质量比为 1∶ 5.
　　
　　2 MePEG-PLGA-HCPT 纳米粒的质量评价
　　
　　2. 1 扫描电镜和透射电镜分析
　　
　　图 1 为优化制备的 MePEG-PLGA-HCPT 纳米粒的扫描电镜照片，从图 1 可以看出，粒子为球形结构，表面圆滑，粒径分布均一，粒径小于 200 nm,成球率高。采用透射电镜观察 MePEG-PLGA-HCPT 纳米粒的结构，其结果如图 2 所示，发现 TEM 与 SEM结果基本吻合。载药纳米粒为实心球形结构，壳核结构明显，表面圆滑，粒径分布均一。
　　
　　2. 2 HCPT 测定方法学考察
　　
　　由于 HCPT 受 pH 值影响存在内酯环和羧酸盐，即闭环和开环两种形式，因此有必要对这两种形式分别进行考察。在实验中分别绘制内酯环和羧酸盐 HCPT 两条标准曲线，便于对二者体外释药的分别定量。在色谱条件下，两种形式的 HCPT 完全分离，内酯环 HCPT 的保留时间为 6. 5 min,羧酸盐HCPT 的保留时间为 2. 9 min; 内酯环 HCPT 标准曲线回归方程为： Y =294.62X -4 721.5（ R2= 0. 997 9） ;羧酸盐 HCPT 回归方程 Y = 252. 85X + 9 555（ R2=0. 997 9） .线性范围为 50 ~ 3 000 ng·mL- 1.
　　
　　因为羟基喜树碱以羧酸盐构型存在时检测灵敏度较低，相同系列浓度响应值很低。因此释药期间，隔时在每个样品组中分别取两份 1 mL 溶出介质，其中一份用醋酸酸化，将 HCPT 全转化成内酯环构型，用来测定此时释放的 HCPT 总量； 另一份未用醋酸酸化，用来测定释放的 HCPT 中酯环构型的含量，两个差值即为 HCPT 中羧酸盐构型的含量。
　　
　　2. 3 MePEG-PLGA-HCPT 纳米粒理化性质表征按照粒径、Zate 电位、包封率和载药量的测定方法，优化制备的 MePEG-PLGA-HCPT-纳米粒平均粒径为（ 120. 1 ± 2. 4） nm; 多分散系数为（ 0. 057 ±0. 021） ; Zeta 电位为（ - 31. 2 ± 0. 98） mV; 包封率为（ 44. 5 ±0. 84） %,载药量为（ 7. 42 ± 0. 23） %; 均为n = 3.
　　
　　2. 4 HCPT 在纳米粒中的状态
　　
　　2. 4. 1 XRD 分析 HCPT、MePEG-PLGA 纳米粒、HCPT 与 MePEG-PLGA 物理混合物、MePEG-PLGA-HCPT 纳米粒进行 XRD 分析，考察 HCPT 存在状态，结果见图 3.
　　
　　结果可见，HCPT 在 5° <2θ <35°范围内呈现许多强结晶衍射峰，表明 HCPT 主要以结晶型存在；MePEG-PLGA 在 2θ = 19. 206° 和 23. 422° 有 2 个特征峰； 而 MePEG-PLGA 与 HCPT 物理混合物兼具两者的特征峰，而且没有其他新生成的峰，表明二者之间无相互作用发生，但是 HCPT 部分衍射峰已经被MePEG-PLGA 所掩盖，且强度有所减弱，表明 HCPT的晶体性质可被 MePEG-PLGA 通过物理混合的手段部分掩盖； 在 MePEG-PLGA-HCPT-NPs 的衍射图谱中，表现出与 MePEG-PLGA/HCPT 物理混合物特征相似的结构特征，HCPT 的晶体衍射峰部分消失，表明在 MePEG-PLGA 纳米粒中，HCPT 与 MePEG-PLGA 处于一种高度分散的状态，其自身的晶体特征被抑制。以上结果说明，HCPT 是以晶体形式存在于 MePEG-PLGA-HCPT-NPs 中，类似研磨后的物理混合物。
　　
　　2. 4. 2 DSC 分析 药物在基质中的分布状态可通过测 定 载 药 基 质 中 药 物 的 吸 收 峰 来 判 断。对HCPT、MePEG-PLGA 纳 米 粒、MePEG-PLGA-HCPT纳米粒进行差热扫描分析。结果见图 4.
　　
　　HCPT 的谱图在 60 和 130 ℃ 有 2 个很尖锐的吸热峰，空白 MePEG-PLGA 纳米粒的谱图只有 1 个特征峰，此峰反映的是 MePEG-PLGA 的玻璃化转变过程中的吸热峰，而在 MePEG-PLGA-HCPT-NPs 的谱图中同时出现了 HCPT 和空白 MePEG-PLGA 纳米粒的吸热峰，但是 MePEG-PLGA 的吸热峰和 HPCT的 1 个吸热峰发生了前移现象，原因可能是 HCPT和 MePEG-PLGA 在透析过程中二者相互缠绕在一起，降低了彼此的吸热能量所致，而二者的性质没有发生根本变化。
　　
　　2. 4. 3 HCPT 在纳米粒中的分布（ CLSM） 为了观察 HCPT 在 MePEG-PLGA 纳米粒内的分布，采用激光共聚焦显微镜对 MePEG-PLGA-HCPT 纳米粒进行扫描，见图 5.由于 MePEG-PLGA 没有荧光，所以图中绿色部分代表 HCPT.验证了 HCPT 均匀分散在MePEG-PLGA 纳米粒中，为基体式缓释体系。同时，这些图片从另一角度证明了载药纳米颗粒的壳核球体结构。
　　
　　3 体外释药行为考察
　　
　　图 6 为 MePEG-PLGA-HCPT 纳米粒在 pH 6. 8,7. 4,8. 0 的条件下，30 d 内体外释药曲线，其 HCPT累积释药量分别为 53. 3%,63. 1%,83. 3%.可见MePEG-PLGA-HCPT 纳米粒具有一定的缓释作用，能显着延长 HCPT 的释放，长效作用更加明显。在pH 8. 0 条件下，HCPT 以内酯环形式、羧酸盐形式共同存在（ 见图 7） ,其中羧酸盐形式 HCPT 累积释药量为 72%,内酯环形式 HCPT 累积释药量保持为11% 左右。
　　
　　讨 论
　　
　　通常，内酯环形式的 HCPT 不溶于水，微溶于有机溶剂，这一特点使得药物难以载入到聚合物载体中。而羧酸盐形式的 HCPT 具有水溶性特征，并可以通过与 NaOH 调节 pH 得到。但是这种羧酸盐形式的 HCPT 表现为极低的抗拓扑异构酶 I 活性，所以本研究中我们考虑利用透析外水相的酸性环境来使载入到聚合物中的羧酸盐形式的 HCPT 重新转变成高药效的内酯环形式。然后，利用去离子水透析，除去多余的酸碱盐。本方法充分运用透析法的特点利用 HCPT 的溶解性、药效性的 pH 可控特点，较好地制备出载羟基喜树碱双嵌段共聚物纳米粒。
　　
　　由于包封率对液体制剂才有较高的意义，对于冻干制剂，载药量是最为重要的。而本研究为冻干制剂。所以，虽然所得到的载药纳米粒包封率并不高，仅 44. 5%,但 却 有 着 较 高 的 载 药 量，高 达7. 42% ,具有重要的应用价值，与已研究的 HCPT 纳米制剂相比有着明显的高载药量优势[7 -8].
　　
　　MePEG-PLGA-HCPT 纳 米粒在 3 个 pH 值的PBS 释药行为中，呈现双相释放特征，前半部分的突释主要由于吸附在纳米粒子表面药物的扩散，而后部分的缓释主要是包裹在纳米粒中药物的释放。此外，随着释放介质 pH 值的上升，药物释放速率上升，这是因为 HCPT 在碱性条件下易由内酯环形式转变为水溶性羧酸盐形式的 HCPT,更易释放到缓冲溶液中的缘故。
　　
　　MePEG-PLGA-HCPT 纳米粒在 30 d 的体外释放试验中释药较慢，其释药量不能达到 100%,可能是由于 MePEG-PLGA 的降解速度很慢，所以还有部分药物残留在纳米粒中； 此外，大部分药物以晶体形式分散在聚合物中，其不溶于水或微溶于中性的透析液中，也延缓了药物的释放。这也进一步表明了本法制备的载药粒子具有较好的缓释效果。体外释药曲线仅表示该纳米粒具有较长的缓释效果，而通过其体内释药情况来评价抗肿瘤作用，还有待于进一步研究。预计在体内时有各种酶的存在和肿瘤组织中的环境可能会加速 HCPT 释放。
　　
　　本研究成功制备了高载药量、具有一定缓释功效的长循环双嵌段共聚物 MePEG-PLGA-HCPT 纳米粒，为 HCPT 提供了一种新的缓释剂型。后续的研究将进一步探索细胞生物学效应、药效学等研究，为未来的开发应用提供理论依据。
　　
　　[ 参 考 文 献 ]
　　
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