在过去近 20 年中，随着生物技术药物的迅速发展，单克隆抗体药物在恶性肿瘤和自身免疫性疾病的治疗中发挥着日益重要的作用，其中抗 CD20 的治疗性单克隆抗体是最早被应用的，成为单抗药物的典型代表[1].
　　
　　第一个抗 CD20 单克隆抗体药物利妥昔单抗（ Rituximab） 于1997 年被 FDA 批准上市，为人/鼠嵌合型单抗，大量研究显示其治疗非霍奇金淋巴瘤（ non-Hodgkin's lymphoma,NHL） 的有效性和安全性良好，对于该病的治疗产生了重大影响[2].B 细胞淋巴瘤是 NHL 最主要的一种类型，近年来在世界范围内发病率有明显上升[3].90% 以上的 B 细胞淋巴瘤（ B-NHL） 细胞和正常 B 淋巴细胞上表达有CD20 抗原，而在造血干细胞、原始 B 淋巴细胞、晚期分化的浆细胞以及其他组织上不表达该抗原[4].
　　
　　CD20 抗原稳定结合于细胞膜表面，不存在循环中，不会竞争性抑制抗体与淋巴瘤细胞结合； 该抗原与抗体结合后不会发生内化（ internalize） 或从细胞膜表面脱落，因此 CD20 抗原是生物免疫治疗 B-NHL的理想靶点[5 -7].除治疗 NHL 外，利妥昔单抗在2007 年还被 FDA 批准用于治疗难治性类风湿性关节炎，在 2011 年被批准用于治疗韦格纳肉芽肿和显微镜下型多血管炎等疾病。此外，该药还被用于治疗膜性肾病、膜性增殖性肾小球肾炎和狼疮性肾炎[8 -9].
　　
　　第 2 代已上市抗 CD20 单抗药物是 ofatumum-ab,是 GSK 和 Genmab A / S 公司生产的全人源的IgG1 kappa 单克隆抗体，于 2011 年分别在美国和欧洲上市。其他一些抗 CD20 单抗药物目前仍在临床研究或临床前研究中[10].重组人-鼠嵌合抗 CD20单克隆抗体 IBI301 是由我国制药企业研发的利妥昔单抗仿制药，拟用于治疗 NHL.本研究对食蟹猴按剂量递增法进行了单次静脉注射给药，观察食蟹猴产生的急性毒性反应及其严重程度、主要毒性靶器官，为考察 IBI301 耐受剂量并为药物的重复给药毒性研究剂量设计和主要观察指标提供参考。
　　
　　材料和方法
　　
　　1 供试品和对照品
　　
　　重组人-鼠嵌合抗 CD20 单克隆抗体（ 代号：IBI301,批号： A20120301,为无色澄明溶液，有效成分浓度 10 mg·mL- 1） ; 溶媒成分及浓度： 枸橼酸钠（ 7. 35 mg·mL- 1） 、聚山梨醇酯 80（ 0. 7 mg·mL- 1） 、9 mg·mL- 1氯化钠和注射用水。给药用 IBI301 供试品均为 10 mg·mL- 1原液。供试品、溶媒均由信达生物制药（ 苏州） 有限公司提供，2 ~ 8 ℃ 条件下避光保存。
　　
　　2 实验动物和饲养条件
　　
　　实验共使用 2 ~3 岁普通级食蟹猴 4 只，雌、雄各半，繁育单位为广东省肇庆创药生物科技有限公司，许可证号： SCXK（ 粤） 2007-0016.购入时体重范围： 雌性 2 只均为 2. 20 kg,雄性为 2. 55 ~ 3. 40 kg.
　　
　　不锈钢金属丝网笼单笼饲养，饲养室控制温度 16 ~26 ℃ ,日温差≤4 ℃ ,相对湿度 40% ~ 70% ,换气次数为每小时 8 ~10 次，每天 12 h 照明。动物每天定量喂食膨化猴料和水果各 150 g（ 北京科澳协力饲料有限责任公司） ,自由饮用自来水。动物购入后检疫、适应环境 4 周后用于实验。
　　
　　3 试剂和仪器
　　
　　CD20+,CD40+细胞流式测定用荧光标记抗体：PerCP Mouse Anti-Human CD3,PE Mouse Anti-Hu-man CD20,FITC Mouse Anti-Human CD40 （ BDPharmingen） ; 血液学测定用试剂（ 北京佳康瑞得医用电子仪器有限公司） ; 血清生化测定用试剂（ 北京周天华枫医疗仪器有限公司） .
　　
　　FACS calibur 流式细胞仪（ 美国 BD 公司） ; AD-VIA 120 血液分析仪和 Rapidchem 744 电解质分析仪（ 德国拜耳公司） ; HITACHI 7180 型全自动生化分析仪（ 日本日立公司） ; FX 7102 心电图机（ 北京福田电子医疗仪器有限公司） ; 显微镜（ 日本 Olym-pus 公司） ; Tissue-Tek TEC 包埋机、Tissue-Tek VIP6-E2 脱水机、Tissue-Tek DRS 染色机、Tissue-Tek Glas封片机（ 日本 Sakura 公司） ; MICROX SPINNER 血细胞离心涂片机（ 日本 Omron 公司） .
　　
　　4 研究设计
　　
　　组别、剂量、给药途径和方法： 实验共使用 4 只食蟹猴，设置 2 个组别： 溶媒对照组、IBI301 给药组。
　　
　　每组 2 只动物，雌雄各半。对给药组动物先单次给予 100 mg·kg- 1的 IBI301,如动物能耐受该剂量，则采用剂量递增的方法，2 周后对该组动物给予 160mg·kg- 1的剂量，溶媒对照组动物也在同一时间再次给予溶媒。每一剂量给药 1 次。按 kg 体重折算，对食蟹猴给予的 2 个剂量 100 mg·kg- 1（ 1 492 mg·m- 2） 和 160 mg·kg- 1（ 2 388 mg·m- 2） ,分别为临床给药剂量的 10 和 16 倍。给药途径为下肢静脉注射，首次给药体积为 10 mL·kg- 1,提高剂量后二次给药体积为 16 mL·kg- 1.采用微量注射泵静脉缓慢推注，速度为 3 mL·min- 1.
　　
　　毒性评价指标： 实验期间观察动物的临床症状、注射部位刺激性，测定体重、体温、心电，进行血液学、血 液 凝 固 和 血 清 生 化 检 查、外 周 血 CD20+CD3-/ CD40+细胞测定，二次给药结束后 2 周对所有实验动物进行麻醉、解剖和大体病理学检查，对发现的异常病变采集组织样本进行组织病理学检查。
　　
　　血液学检查指标包括： 白细胞数（ WBC） 、红细胞数（ RBC） 、血红蛋白含量（ HGB） 、红细胞比容（ HCT） 、平均红细胞容积（ MCV） 、平均红细胞血红蛋白 含 量 （ MCH） 、平 均 红 细 胞 血 红 蛋 白 浓 度（ MCHC） 、网织红细胞百分比和绝对计数、血小板数（ PLT） 、平均血小板容积（ MPV） 、白细胞分类百分比和绝对计数。
　　
　　血清生化检查指标包括： 天门冬氨酸氨基转换酶（ AST） 、丙 氨 酸 氨 基 转 换 酶 （ ALT） 、尿 素 氮（ BUN） 、肌 酐 （ CRE） 、总 蛋 白 质 （ TP） 、白 蛋 白（ ALB） 、A/G、葡萄糖（ GLU） 、肌酸激酶（ CK） 、碱性磷酸酶（ ALP） 、总胆红素（ TBIL） 、总胆固醇（ CHO） 、甘油三酯（ TG） 、乳酸脱氢酶（ LDH） 、IgG、IgM、C3、C4、K+、Na+、CL-.
　　
　　组织病理学检查： 对大体病理学检查发现异常的给药组动物脾脏和溶媒对照组动物脾脏，用 10%中性缓冲福尔马林溶液进行固定保存，修块取材，逐级酒精脱水，石蜡包埋，滑动切片机切片 （ 厚约3 μm） ,经苏木精-伊红（ HE） 染色，光镜下进行组织病理学检查。其他组织器官不进行固定保存。
　　
　　5 数据统计分析
　　
　　对各项检查指标不进行统计学处理，列出个体动物的观察数据和测定数据，进行给药组与对照组间及给药前后动物个体数据的比较分析。
　　
　　结 果
　　
　　1 症状观察、注射部位观察、体重、摄食量、体温、心电图测定结果溶媒对照组和给药组动物在首次和二次给药后2 周观察期内均未见明显异常症状，均无动物死亡。
　　
　　每次给药后 1 周内对注射部位进行肉眼观察，未见异常改变。检疫和给药期间，溶媒对照组和给药组动物的体重均保持相似的增长趋势，IBI301未对动物的体重增长产生影响（ 见表 1） .检疫期、首次给药后和二次给药后 2 h、二次给药后 2周，溶媒对照组和给药组动物的体温均在食蟹猴正常的体温范围内，IBI301 未对动物的体温产生明显影响（ 见表 2） .溶媒对照组雌性动物在实验期 d 11 有 25% 的剩食量，给药组雌性动物在实验期 d 12,d 16 天均有 25% 的剩食量，未见其他动物剩食。检疫驯化期d 9,d 17,首次给药后和二次给药后约2 h、二次给药后2 周测定心电图，溶媒对照组和给药组动物各项心电图指标在给药前后均无明显改变。
　　
　　2 外周血 CD20+CD3-,CD40+细胞检测结果检疫期、首次给药后1 d 和5 d、二次给药后1 d、二次给药后 2 周分别进行了外周血 CD20+CD3-,CD40+细胞测定。首次给药后 1 d,给药组的 2 只动物 CD20+CD3-细胞比例显着降低，至首次给药后 5 d 均降为 0,二次给药后 1 d 仍在很低水平，二次给药后 2 周略有上升。首次给药后 5 d,给药组的 2 只动物 CD40+细胞比例显着降低，二次给药后 1 d 和二次给药后 2 周仍保持很低水平（ 见表 3） .
　　
　　3 血液学和血凝检测结果
　　
　　检疫期 d9,d17、首次给药后和二次给药后1 d、二次给药后 2 周对动物分别采血进行血液学和血液凝固学检测。
　　
　　首次给药（ 100 mg·kg- 1） 后 1 d,给药组雌性动物淋巴细胞百分比和绝对计数较检疫期明显降低，而中性粒细胞百分比较检疫期明显增加； 二次给药（ 160 mg·kg- 1） 后 1 d,给药组雌、雄动物淋巴细胞百分比和绝对计数较检疫期明显降低，中性粒细胞百分比和绝对计数均较检疫期明显增加，其中雌性动物在首次和二次给药后中性粒细胞、淋巴细胞的结果接近。给药组两只动物在给药前后白细胞总数未见明显变化（ 除雄性动物在二次给药后 2 周白细胞总数有所降低外） .二次给药后 2 周，给药组上述中性粒细胞和淋巴细胞的变化有所恢复，以雄性动物更为明显。其他血液学和血液凝固学指标在各组间及各只动物给药前后未见明显改变（ 见表 4） .
　　
　　4 血清生化和电解质检测结果
　　
　　检疫期 d 9,d 17、首次给药后 1 d、二次给药后1 d、二次给药后 2 周对动物采血进行血清生化检测。首次给药后 1 d,给药组雌性动物的血清 ALT,AST,CK,LDH 检测值偏高，但在二次给药后 1 d 和 2周检测时未见明显异常，给药组雄性动物未见类似改变，认为可能是偶发的异常改变或与应激有关，非给予供试品所致。各组间及各只动物给药前后未见其他血清生化和电解质指标的明显改变。
　　
　　5 病理学检查结果剖检结果： 本实验动物剖检时，发现先后给予100 和 160 mg·kg- 1IBI301 的给药组动物脾脏体积变小，其余组织器官未见异常。溶媒对照组动物各组织器官未见异常。
　　
　　镜检结果： 镜下给药组动物脾脏均发现中度白髓淋巴细胞数目减少，该组织病理学变化与大体病理学检查发现的脾脏体积变小密切相关，溶媒对照组未见异常（ 见图 1） .脾脏白髓淋巴细胞数目减少与给予供试品相关。
　　
　　讨 论
　　
　　近年来，靶向治疗的单克隆抗体药物在治疗肿瘤和某些免疫性疾病方面已显示出显着的临床优势，抗 CD20 的治疗性单克隆抗体是其中最为成功的代表，极大地影响了该类疾病的治疗[1].
　　
　　本研究对食蟹猴先后单次静脉注射 2 种不同剂量的 IBI301,观察其产生的毒性反应及严重程度、主要毒性靶器官，考察耐受剂量，评价药物的急性毒性，并为重复给药毒性研究剂量设计和主要观察指标提供参考。根据原研药的毒性研究相关资料报道，食蟹猴单次静脉注射给予 0. 05 mg·kg- 1剂量的利妥昔单抗，可引起部分 B 细胞损耗，5 和 10 mg·kg- 1的剂量可引起外周血及外周淋巴组织几乎完全的 B细胞耗竭[11 -12].利妥昔单抗治疗 B 细胞型非霍奇金氏淋巴瘤的临床最高剂量为 375 mg·m- 2,约相当于 10 mg·kg- 1 [13].IBI301 是利妥昔单抗的生物类似药，与利妥昔单抗的结构和药理作用基本一致。
　　
　　因此，根据本供试品的特点及相应参考资料，本研究首先观察食蟹猴对 100 mg·kg- 1（ 1 492 mg·m- 2） 剂量 IBI301 的耐受情况，结果显示给药后 2 周内，动物除药效作用相关的改变外未见其他异常改变，因此认为100 mg·kg- 1IBI301 未对动物产生明显毒性、动物状态良好，可以用于剂量递增的再次给药。在 2周后对相同动物给予 160 mg·kg- 1（ 2 388 mg·m- 2）IBI301,以进一步考察食蟹猴对本供试品的耐受剂量。按 kg 体重折算，对食蟹猴给予的 2 个剂量分别为临床给药剂量的 10 和 16 倍； 按体表面积折算，分别为临床给药剂量的 4 和 6. 4 倍。食蟹猴单次静脉滴注 IBI301 药动学研究结果显示，100 mg·kg- 1IBI301 给药后血浆半衰期约为 109 h,即约 4. 5 d,因此 2 周后再次给予 IBI301 时，已经过 3. 1 个半衰期，首次给药后的药物残留应该已经很少，对于高剂量 160 mg·kg- 1的急毒给药，其影响应该可以忽略。
　　
　　供试品如果能诱导产生抗体，一般是在给药后 2 周时刚刚开始，所以间隔两周给药应该不会受到抗药抗体的明显影响。这样利用有限的动物较好地考察了供试品的耐受剂量。食蟹猴与人同属灵长类，基因同源性高，免疫学反应有很多相似性，其国内外背景资料丰富，是生物技术药物一般毒性研究的常用实验动物。国外类似药物的临床前毒性研究显示食蟹猴对抗 CD20 单克隆抗体敏感[14 -15].因此，本研究选用食蟹猴作为实验动物。
　　
　　溶媒对照组和给药组动物在给药期和观察期内均未见明显异常症状，无动物死亡，注射部位未见异常改变。检疫和给药期间，溶媒对照组和给药组动物的体重均保持相似的增长趋势，IBI301 未对动物的体重增长产生影响。溶媒对照组雌性动物在实验期 d 11 有 25%的剩食量，给药组雌性动物在实验期d 12,d 16 均有 25% 的剩食量，未见其他动物剩食。
　　
　　因剩食发生的频率很小，剩食量较少，且在溶媒对照组和给药组均有分布，因此认为剩食为偶发现象，与给予 IBI301 无关。IBI301 未对动物的体温和心电图指标产生明显影响。
　　
　　本研究流式测定结果显示 IBI301 静脉注射后迅速引起 CD20+CD3-细胞、CD40+细胞数量显着减少甚至消失。CD20+CD3-细胞可基本代表 B 淋巴细胞，B 细胞同时也是 CD40 抗原的主要表达细胞之一。本实验的供试品为重组人-鼠嵌合抗 CD20单克隆抗体，它与 B 淋巴细胞表面的 CD20 抗原结合后，能启动介导 B 细胞溶解的免疫反应。以上结果显示 IBI301 静脉注射可引起食蟹猴 B 淋巴细胞迅速减少甚至消失，在二次给药后 2 周未见显着恢复，IBI301 在食蟹猴具有明显的药效学作用。溶媒对照组和给药组 CD20+CD3-细胞比例在检疫期测定时即有较大差异，因操作条件一致，认为是由于动物个体差异引起的。
　　
　　血液学检查结果显示，100 和 160 mg·kg- 1IBI301 给药后引起食蟹猴淋巴细胞百分比和绝对计数明显降低、中性粒细胞百分比明显增加。考虑到本供试品介导 B 淋巴细胞溶解的药理作用，认为以上变化与给予供试品有关，是由于 IBI301 介导 B 淋巴细胞减少、进而引起外周血淋巴细胞计数和百分比减少，并间接影响中性粒细胞的百分比。二次给药后 2 周，给药组上述中性粒细胞和淋巴细胞的变化有所恢复。血清生化测定结果显示本供试品未引起血清生化和电解质指标的明显改变。食蟹猴静脉注射 IBI301 急性毒性研究中，组织病理学检查发现给药组动物脾脏均出现中度白髓淋巴细胞数目减少，该变化与该组动物脾脏体积变小的大体病理学检查发现相符合。脾脏白髓富含 B 淋巴细胞，因此上述发现是该供试品发挥药效作用的结果。
　　
　　在本实验条件下，食蟹猴分别单次静脉注射100 和 160 mg·kg- 1IBI301,除观察到与药效作用相关的改变（ 主要作用靶点为 B 淋巴细胞，靶器官为脾脏） 外，未见其他明显的毒性作用。本研究为考察 IBI301 耐受剂量和急性毒性作用提供重要结果，并为重复给药毒性研究剂量设计和主要观察指标提供重要参考。
　　
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