0 引言
　　
　　血管平滑肌细胞（ vascular smooth muscle cell,VSMC） 的迁移和增殖是动脉粥样硬化（ athemsclerosis,AS） 病变的发病基础，VSMC数量越多，越易引起动脉粥样硬化[1].从理论上分析，临床可用从促进 VSMC 凋亡、抑制其过度增殖方面来治疗 AS.
　　
　　丹参酮ⅡA（ tanshinoneⅡA,TA）是从丹参中提取的有效成分，有抑制血管损伤后平滑肌细胞增殖的效用。本研究重点探讨丹参酮 IIA 对血管平滑肌细胞 CyclinD1 和 CDK4 的表达的影响。
　　
　　1 材料与方法
　　
　　1.1 实验材料
　　
　　兔 VSMC 细胞株购自北京大学基础医学院细胞培养中心。同型半胱氨酸（25 g/ 瓶，纯度≥ 98%,批号 : C-7352）购自Sigma 公司。丹参酮Ⅱ A（ 20 mg/ 瓶，批号 : 200619）购自中国药品生物制品鉴定所；鼠抗人 CyclinD1 单抗（1:100） ,兔抗人 CDK4 单抗（ 1:100） 试剂均购自 Santacruz.USA;所用仪器包括 FACS Calibur 流式细胞仪（BD.USA 公司）、209b 型超净工作台、Hera C02细胞培养箱（德国 GMBH ）、BH-NIC-B型倒置显微镜（日本 Olympsu Optical） .
　　
　　1.2 实验方法。
　　
　　1.2.1 细胞培养与实验分组。在 37℃、5% CO2条件下，用 100mg/L 的链霉素与青霉素、PRMI-1640 培养基培养兔 VSMC,取处于生长期的第三代到第五代细胞用于实验。按 1×108/L 密度稀释后接种于96 孔培养板，培养24 h.将细胞分为HCY 模型组、丹参酮Ⅱ A 处理组和空白对照组，每组设 6 个复孔。HCY 模型组、丹参酮Ⅱ A 处理组均加入 10-4 mol/L 同型半胱氨酸，培养24 h 后，丹参酮Ⅱ A 组加入 0.25 mg/L 的丹参酮Ⅱ A,培养 48 h.空白对照组不予处理。
　　
　　1.2.2 细胞周期分析。取生长状态良好的细胞制备细胞悬液，1000r/min离心 5min,取沉渣后用 PBS洗涤 2次，用预冷的 70%乙醇固定，置于处 4℃冰箱避光冷藏。800 r/min 离心 10 min,PBS 清洗 2 次； 重悬细胞于 100 unit/mL RNaseA 的 PBS 缓冲液中，37 ℃下温浴 30 min;加碘化丙锭（ PI）混匀，避光孵育 30min.用流式细胞术（FCM）检测细胞周期中不同时相的细胞数。
　　
　　1.3 检测指标。调整细胞浓度为 1×106/mL 个，取细胞悬液置于试管中，加入鼠抗人 CyclinD1、兔抗人 CDK4 单抗 100μL,室温孵育 30min,PBS 洗涤 1 次，500 r/min 离心 5 min,加入FITC - IgG,避光室温孵育 30 min,PBS 1 次，离心弃上清液后加入 1 mL PBS 液，500 目铜网过滤后上机检测 CyclinD1、CDK4的表达，每份标本测定 5 000 个细胞。
　　
　　1.4 统计学方法。采用 SPSS 20.0 软件包进行分析，VSMC 增殖周期细胞数和 CyclinD1、CDK4 的表达等计量资料用（-χ-± s ）表示，采用t 检验。P< 0. 05 为差异有统计学意义。
　　
　　2 结果
　　
　　2.1 丹参酮Ⅱ A 对 VSMC 细胞增殖周期的影响。丹参酮Ⅱ A 组和空白对照组各期细胞数比较无明显差异（P>0.05）；丹参酮Ⅱ A 组 G0 /G1 期细胞数明显高于 HCY 组，S 期、 G2 /M 期细胞数明显低于 HCY 组（P<0.05）。见表 1.

　　
　　2.2 丹参酮Ⅱ A 对 VSMC CyclinD1、CDK4 表达的影响。丹参酮ⅡA 组细胞CyclinD1、CDK4 表达均显着低于HCY 组（P<0.05）。见表 2.

　　
　　3 讨论
　　
　　动脉粥样硬化（AS）的发生发展和血管内皮细胞损伤、血管平滑肌细胞（VSMC）克隆增殖、血管壁脂质浸润、血栓形成及各种黏附分子介导的炎症反应等密切相关，血管内皮细胞损伤是导致动脉粥样硬化的首发因素[2],血管平滑肌细胞的增殖、吞噬脂质转变成泡沫细胞、形成粥样斑块是导致动脉粥样硬化发生发展的核心因素。因此，抑制、阻断血管平滑肌细胞的增殖、促其凋亡可有效防治动脉粥样硬化。
　　
　　在所有真核细胞中，细胞周期的各个环节的起始与进程均通过细胞周期蛋白（ Cyclin）和细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）的共同调控作用[3],CyclinD1、CDK4 均为重要的细胞周期蛋白调控基因，前者随细胞周期不同时相进行合成和降解，后者通过有序的磷酸化和去磷酸化来调节细胞增殖，二者控制着细胞的增生和凋亡[4].
　　
　　随着动脉粥样硬化研究的不断深入，有学者发现某些中药或其有效成分可通过阻断诱导动脉粥样硬化细胞的过度增殖，促进 VSMC 凋亡[5-6].丹参酮Ⅱ A 是从丹参中提出出的脂溶性有效成分，具有降压、改善微循环、扩张冠状动脉、抑制血小板聚集、预防血管平滑肌细胞增殖等药理作用，多用于治疗心血管疾病[7].本文将丹参酮Ⅱ A 应用于 HCY 诱导的 VSMC 研究中，结果表明，丹参酮Ⅱ A 组 G0 /G1 期细胞数增多，S 期、 G2/M期细胞数明显减少，提示丹参酮ⅡA 可使VSMC阻滞于G1期，具有拮抗 VSMC 增殖的作用。丹参酮Ⅱ A 组细胞 CyclinD1、CDK4 表达均显着低于 HCY 组，提示丹参酮Ⅱ A 阻滞 VSMC 细胞周期的机制可能与 CyclinD1 及 CDK4 的低表达有关。本文研究的局限性在于缺乏对不同剂量丹参酮Ⅱ A 的研究，今后将在实验过程中进一步探讨。
　　
　　参考文献
　　
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　　[3] Ghatak S B,Dhamecha P S,Bhadada S V,et al. Investigation ofthe potential effects of metformin on atherothrombotic riskfactors in hyperlipidemic rats[J]. Eur J Pharmacol.2011,659（2-3）： 213-223.
　　
　　[4] 康郑军 , 李伟 , 王坦 , 等 . 丹参酮Ⅱ A 诱导 PC-3 细胞凋亡的细胞周期调控机制 [J]. 中国老年学杂志 , 2014,17:4899-4900.
　　
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　　[6] 付强，张妍，沈晓君，等 . 丹参酮Ⅱ A 对血管平滑肌细胞内质网应激相关基因表达的影响 [J]. 中国实验方剂学杂志，2013,19（14）：280-283.
　　
　　[7] 杨征，邱敏 . 丹参酮Ⅱ A 的心血管作用及机制研究进展 [J]. 中国动脉粥样硬化杂志，2011,19（4）：372-374.

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