犬瘟热（Canine distemper,CD）是由犬瘟热病毒（Canine distemper virus,CDV）引起的一种世界范围内多种肉食动物多系统感染的病毒性传染病。

　　CDV自然感染宿主除食肉目所有8个科外，还扩展到偶蹄目猪科、灵长目的猕猴属和鳍足目海豹科等多种动物[1].CDV属于副黏病毒科麻疹病毒属的单股负链线性RNA病毒，同属的病毒有麻疹病毒（Measles virus,MV）、牛瘟病毒（Renderpest virus,RPV）等，总编码8种蛋白，主要有核衣壳蛋白（nu-cleocapsid protein,N）、磷蛋白（phosphoprotein,P）、基质膜蛋白（matrix protein,M）、融合蛋白（fusionprotein,F）、附着或血凝蛋白（attachment protein orhemagglutinin protein H）、大蛋白（the large virusspecificied RNA directed RNA polymerase protein,L）6种。

　　血凝蛋白（H）是CDV囊膜表面主要糖蛋白之一，CDV通过H蛋白吸附到细胞受体上来启动病毒感染过程，因此H蛋白决定了CDV的宿主特异性和组织嗜性。其变异率在所有结构蛋白中最高（变异率由高到低依次为H、N、L、P、F、M），是宿主范围扩大和新基因型出现的重要原因。基于H基因的变异性，CDV被分为9种与地域相关的基因型：

　　America-Ⅰ、America-Ⅱ、Arctic、Asia-Ⅰ、Asia-Ⅱ、European wildlife、South Africa、Europe/SouthAmerica-Ⅰ、South America-Ⅱ。

　　细胞表面受体是导致病毒的组织嗜性和感染宿主范围的重要因素，CDV的跨种间传播现象与其感染宿主的细胞受体表达有密切关系，至今已发现信号淋 巴 细 胞 激 活 因 子 （SLAM）和 黏 连 蛋 白4（PVRL-4/nectin-4）分别作为CDV的淋巴细胞和上皮细胞受体。本文就近年来犬瘟热病毒H基因变异及其细胞受体的研究进展进行综述。

　　1 H基因及其蛋白功能

    1.1 H基因H蛋白基因由1 946个核苷酸组成，包含一个大的开放阅读框，起始于21位点，终止于1 835位点，编码一个含有605个氨基酸的蛋白质。在胞外域上，该蛋白质包含3个潜在的糖基化位点以及类似于其他副黏病毒的一个N末端跨膜疏水性锚定域。此外，CDV的H基因在核苷酸水平上与牛瘟病毒（RPV）具有52%的同一性，与麻疹病毒（MV）有36%的同一性，但推导的H蛋白序列与RPV和MV有36%的同一性，与MV和RPV的H蛋白相比，CDV的H蛋白氨基酸序列表现对所有结构因素具有保护性，此数据也表明，在H基因方面显示出CDV与PRV和MV的等距进化[2].

　　1.2 H蛋白功能

　　H蛋白是构成囊膜纤突的主成分，能够诱导机体产生中和抗体，是抗CDV免疫中很重要的抗原。野毒株和疫苗株H蛋白的潜在糖基化位点不同，糖基化位点不同可能影响病毒的抗原性[3].2000年，日本学者用抗CDV H蛋白的4种单克隆抗体（JD-5、JD-7、JD-11和d-7）分析日本CDV野毒株和疫苗株的抗原特性，发现H蛋白的抗原区与中和反应有关，其中d-7、JD-5和JD-11 3种单克隆抗体对所有CDV反应相似，但JD-7与疫苗株和较早的野毒株反应强烈，与新野毒株反应较弱，该方法可用于鉴别新毒株[4].

　　CDV的包膜蛋白H对宿主细胞融合起主要作用。尽管CDV H蛋白的结构尚未完全解决，但基于麻疹病毒H蛋白的三维模型，发现几个氨基酸残基 （例 如D505、D507、Y529、D530、T531、R533、F552、Y553和P554）与细胞受体SLAM的相互作用非常重要[5].

　　CDV H蛋白跟细胞受体的结合决定病毒的组织嗜性。有研究指出CDV适应犬足垫角质细胞（CFKs）与P/V/C、M、H蛋白上3个氨基酸改变有关，其中改变的P/V/C上的氨基酸有助于提高病毒滴度，改变H蛋白胞质端的氨基酸对细胞的致病性有影响[6].

　　2 H蛋白的高变异率

　　H蛋白是麻疹病毒属病毒所有蛋白中变异率最高的蛋白。如2株CDV基因序列差异超过10%,就可以通过H蛋白抗原差异进行区别。因此单克隆抗体常用于区别野毒株和疫苗株[7].H蛋白变异主要反映在基因同源性差异、氨基酸位点突变、抗原表位漂移和糖基化位点变化等方面。许多流行病学调查资料显示当前流行的CDV野毒株与疫苗株的H基因和氨基酸同源性差异大。

　　郭玲等[8]对2002年-2010年 中 国 分 离 的14株CDV野毒株、2006年-2007年全球各地分离的12株CDV野毒株及从不同宿主分离的12株CDV野毒株和4株疫苗株的H基因进行遗传变异分析发现，CDV野毒株与疫苗株间H蛋白基因的核苷酸相似 性 为86.2% ~92.1%,其 氨 基 酸 相 似 性 为89.1%~91.9%.有研究发现新宿主分离的CDV常在530位点和549位点上发生氨基酸替换，提示犬瘟热在非犬宿主上传播与这2个位点的变异有关[9].朱春生等[10]2011年-2013年从水貂、狐狸和貉源犬瘟热阳性病料中分离出7株CDV野毒株，其中3株水貂和狐狸源CDV的H蛋白氨基酸在第549位点由Y突变成H,2株水貂源CDV H蛋白的受体结合区因第542位氨基酸I→N突变而增加了1个潜在N-糖基化位点，可能预示着CDV进化过程中H蛋白突变对非犬宿主（狐狸、水貂）的适应性增强。在免疫压力作用下，CDV抗原表位可以发生漂移。王国超等[11]对石河子垦区患病犬的流行株和疫苗株H蛋白基因进行抗原表位预测，发现两者抗原表位差异显着；CDV H蛋白糖基化位点差异与其抗原性和毒力密切相关，野毒株的潜在糖基化位点为8个~9个，疫苗株中除Onderstepoort有4个糖基化位点外，Convac、CDV3和Lederle株均含有7个糖基化位点。有研究[12]在2013年对广州地区100份患病犬进行CDV流行病学调查，发现309位的糖基化位点为CDV野毒株所特有，第584位的糖基化位点只在Asia-Ⅰ中发现。

　　3 H基因变异导致CDV宿主范围扩大

　　H蛋白作为CDV细胞受体的结合位点，其变异情况对CDV的宿主范围和趋性有极大影响。H蛋白变异性最大，被广泛用于确定CDV变异程度来划分基因型。根据近期全球CDV流行病学报道，在犬科及其他非犬科上均发现H蛋白变异大的CDV野毒 株。

　　2014年，日 本 学 者 从 犬 中 分 离 到2株CDV,即Yanaka和Bunkyo-K毒株，Yanaka毒株无毒性且能诱导抗体反应，用作疫苗接种犬后，发现其能有效诱导CDV中和抗体，且不表现临床症状，诱导的免 疫 保 护 反 应 与 强 毒 株 均 等，优 于 疫 苗 株；Bunkyo-K毒株能在犬大脑内增殖，使其毒力增强，产生典型的CDV临床症状[13].同年，中国学者也从藏獒中分离到一株CDV新毒株（TM-CC），属于Asia-Ⅰ型，对该毒株和Onderstepoort疫苗株H基因序列同源性分析发现仅有90.4%相似性，编码的氨基酸相似性仅88.9%[14].很多 非 犬 科 类 的 食 肉 动 物 也 能 感 染CDV.

　　2008年，德国巴伐利亚野生动物暴发CDV并引起脑炎症状，经氨基酸序列比对发现，从患病动物分离的6株CDV H基因第549位点发生了Y→H突变[15],结合以前相关研究推测H基因549位点的突变可能会导致CDV新宿主出现。

　　2011年-2013年，中国东北，从已免疫的水貂、狐狸和貉中分离出16株CDV毒株，与同区域不同物种的CDV毒株进行H基因的序列分析，发现H蛋白编码序列的542位点（异亮氨酸→天冬酰胺酸）和549位点（络氨酸→组氨酸）发生氨基酸替换，并在542位点生成一个潜在的新糖基化位点[16].糖基化位点的增加会导致病毒抗原性变化，因此推测糖基化位点变化与CDV逃避疫苗产生的中和抗体有关。大熊猫也能感染CDV,2014年陕西珍稀野生动物4只大熊猫感染大熊猫源CDV死亡，遗传进化分析显示，该毒株属于强毒株，基因型为Asia-I型，与20株具代表性的CDV全基因组序列同源性为91.5%~98.7%[17].

　　除已发现的感染宿主外，近年流行病学调查陆续发现CDV新宿主。意大利学者发现亚平宁山脉狼暴发CDV大量致死，通过H基因序列的系统发育分析该毒株属于Arctic型，这是欧洲野生动物首次报道感染CDV Arctic型[18].2013年首次发现CDV能感染不足400头的珍稀动物东北虎，该虎源CDV H蛋白在538、548和570位点分别发生突变V→I、T→M和D→N,这3个位点均不是H蛋白和SLAM细胞受体结合域的关键氨基酸位点，从而导致CDV感染新兴宿主东北虎[19].

　　犬瘟热病毒还扩大其宿主范围至灵长类，2006年广西某养殖场的猕猴暴发犬瘟热，接着2008年北京动物中心的猕猴发现CDV,同年日本进口自中国的猕猴也感染CDV（CYN07-dV），通过体外试验发现，CYN07-dV毒株对猕猴的SLAM和黏连蛋白4（nectin-4）受体的使用与犬源SLAM和nectin-4一样有效[20].

　　4 CDV受体细胞受体是病毒宿主特异性的一个决定因素。

　　至今，已鉴定出2种CDV的细胞受体，即信号淋巴细胞激活因子（SLAM）和黏连蛋白4（PVRL-4/nec-tin-4）。SLAM仅在淋巴细胞上表达，如：激活的T淋巴细胞和B淋巴细胞、巨噬细胞和树突状细胞；PVRL-4是从上皮细胞上发现的，最近被鉴定为麻疹病 毒 属 的 受 体[21-22].CDV入 侵 时，首 先 通 过SLAM和PVRL-4受体在淋巴和上皮组织复制，再侵入神经系统繁殖，形成持续性感染。有研究发现CDV在不能识别PVRL-4受体时，仍能在星形胶质细胞间传播，大量报道已证明另一受体SLAM不在星形胶质细胞上表达，由此推测胶质细胞存在至今未被发现的第3个CDV细胞受体[23].

　　有趣的是，CDV不需要H基因作相应突变即能使用人类和犬的PVRL-4作为受体，有完整C蛋白的CDV有可能使用人PVRL-4作为受体在人上皮细胞内复制[24].CDV也能通过H基因上一个简单的突变来使 用人类SLAM作 为受体[25].由于CDV可以通过变异而实现种间传播，CDV有可能成为一种潜在的人类病原体。

　　4.1信号淋巴细胞激活因子

　　信号淋巴细胞激活因子（SLAM）也称CD150,是包含有胞质末端和特征信号序列的一类双功能受体，属于免疫球蛋白CD2超家族成员之一。SLAM蛋白分子质量为70ku,由细胞外的V和C2结构域及跨膜区和胞内区组成，具有调控机体淋巴细胞增殖、合成免疫球蛋白和分泌共刺激因子等重要作用。通过不同食肉动物的SLAM核苷酸序列比较和构建SLAM的三维模型，推测有34个氨基酸在食肉动物的SLAM与CDV相互作用结合域中起重要作用[26].

　　SLAM的发现为研究CDV感染机制和病理现象提供了有力的理论基础。黄娟等[27]采用间接免疫荧光法发现水貂SLAM在肝、脾、肺、肾、脑组织中均有分布，CDV感染会引起水貂SLAM受体表达的上调。为研究水貂SLAM受体与CDV结构蛋白的相互作用，王聪等[28]成功获得分子质量约为63.2ku的SLAM-GST融合蛋白。

　　Vero和MDCK细胞作为体外分离CDV的常用细胞系，均不表达CDV的重要受体犬的SLAM,为CDV的分离和生物学特性研究提供一种有效细胞系。朱颖等[29]建立了稳定表达犬SLAM的BHK-21细胞系。不同物种的SLAM氨基酸序列之间有差异，处于61位点的组氨酸及邻近的60位点和63位点氨基酸残基对CDV病毒吸附起关键作用，而PVRL-4在哺乳动物中 较 保 守[26],当SLAM相 比PVRL-4对 决 定CDV宿主特异性作用更大。

　　4.2黏连蛋白4（PVRL-4/nectin-4）

　　2011年PVRL-4被鉴定为MV和CDV的上皮细胞受体[21-22].PVRL-4是黏附分子中黏连蛋白族群的一员。黏附分子属含有黏连蛋白-1、-2、-3、-4和原型脊髓灰质炎病毒受体（PVR）的免疫球蛋白超家族。黏连蛋白主要有黏附作用，是细胞间黏附体系的组成部分，并在限制细胞活动、促进细胞间联系、调节扩散方面起重要作用。

　　PVRL-4是Ⅰ型跨膜糖蛋白并有3个类免疫球蛋白的胞外域（V域，2个C2域）、1个跨膜区、1个胞质区。V域与黏连蛋白间同型和异型交互作用有关，而C2域提高了这些交互作用的亲和力。PVRL-4在多种癌细胞表面表达，并被认为是肺癌、卵巢癌和转移性乳腺癌的肿瘤细胞标志物。

　　MV吸附PVRL-4从而靶向肿瘤细胞使MV作为融瘤细胞替代物具备可能性[30].有研究证明RNAi试验和PVRL-4抗体抑制犬PVRL-4表达能降低CDV滴度和增强型绿色荧光蛋白 （en-hanced green fluorescent protein,EGFP）的荧光反应，犬PVRL-4能促进合胞体形成，试验用siRNA处理受体会抑制合胞体形成[25].2014年有试验证明犬PVRL-4的V域对CDV侵入、细胞间传播、合胞体形成至关重要。此外犬PVRL-4V域中的4个氨基酸（F132、P133、A134、G135）和CDV H蛋白的2个氨基酸（P493、Y539）对受体介导病毒侵入十分重要[24].

　　5结语

　　CDV H蛋白的抗原表位容易发生漂移，引起毒株的抗原性变异，是CDV感染野生动物，甚至感染新宿主或形成新基因型的重要原因。但CDV生物学特性变化原因不仅局限于H蛋白变异。其他结构蛋白如F、P蛋白变化也会使CDV发生变异，因此对各个结构蛋白进行全面分析有助于准确解释CDV宿主范围扩大和形成变异株的原因。基因重组是影响RNA病毒基因多样性的重要因素，在研究CDV基因变异时，不能忽略基因的重组现象。确定CDV变异现象是自身基因变化还是不同基因型发生重组所致具有重要意义。近年犬瘟热疾病暴发频繁，特别在野生保护动物和已免疫动物上，因此加强对犬瘟热病毒流行毒株的监测十分重要。

　　PVRL-4受体的发现对深入研究CDV与细胞受体的相互作用、CDV的感染机制及病毒种间传播原因提供了重要帮助。对CDV受体分布研究有助于明确病毒的宿主范围和组织嗜性。研究CDV与其受体的相互作用机制是阐述病毒的吸附机制以及在体内的扩散方式的重要途径，并为开发治疗犬瘟的新型药物和新型疫苗提供新的思路。随着人们生活水平提高，宠物与人类关系日益密切，而人类与CDV的另一宿主灵长类猕猴亲缘关系相近，CDV新毒株将具有感染人类的潜在可能性，因此对新毒株流行监控及其受体深入研究十分重要。

　　参考文献：

　　[1] 张淼，刘清彪，刘宗架，等。犬瘟热病原学研究进展 [J].中国畜牧兽医，2009,36（11）：162-166.

　　[2]Curran M D,Clarke D K,Rima B K.The nucleotide sequenceof the gene encoding the attachment protein H of canine dis-temper virus[J].J Gen Virol,1991,72（2）：443-447.

　　[3]Iwatsuki K,Miyashita N,Yoshida E,et al.Molecular andphylogenetic analyses of the haemagglutinin（H）proteins offield isolates of canine distemper virus from naturally infecteddogs[J].J Gen Virol,1997,78（1）：3733-3780.

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