摘  要：　目的:通过建立准确测定钩藤中钩藤碱含量的分析方法, 对贵州省不同地区钩藤药材中钩藤碱的含量进行分析研究。方法:采用以二苯胍为内标物的高效毛细管电泳内标法进行含量测定。结果:在所选择的条件下钩藤样品中钩藤碱的电泳峰与杂质成分峰完全分离, 钩藤碱含量得到准确测定。结论:根据测定结果, 主要产于贵州或主要在贵州药材市场上流通的钩藤药材中的钩藤碱含量普遍较低, 有的甚至在该分析条件下未能检出, 这一研究结果可为今后对中药钩藤的研究提供参考依据。

　　关键词：　高效毛细管电泳; 内标法; 二苯胍; 钩藤; 钩藤碱;
 

　　中药钩藤的药效成分为生物碱类, 然而, 现行使用的《中华人民共和国药典》2010版[1]关于钩藤的质量标准至今还没有采用其中的有效成分含量测定进行控制的方法, 因此研究建立钩藤中钩藤碱的有效测定方法就显得很有意义。高效毛细管电泳由于采用压力进样, 装样品溶液的瓶盖密闭性差异造成进样体积差异, 这是导致高效毛细管电泳外标法含量测定精密度差的主要原因。如果采用内标法就可以消除外标法的这一缺陷。通过多次试验, 最终选择了二苯胍为本实验的内标物, 成功地测定了钩藤中的钩藤碱含量。

　　1、 实验材料

　　1.1、 仪器与试剂

　　三维高效毛细管电泳仪, 二级管阵列检测器, 自动进样器 (美国安捷伦公司) ;AE-240双量程电子分析天平, 量程:万分之一和十万分之一两档 (梅特勒-托利多上海有限公司) ;Dela320型p H计 (梅特勒-托利多上海有限公司) ;钩藤碱对照品, 购于上海融合医药科技有限公司 (批号:110726) ;甲醇为色谱纯, 氨水、三氯甲烷、二苯胍均为分析纯;水为娃哈哈纯净水。

　　1.2、 药材

　　药材样品为表2所列样品, 均经贵阳中医学院付志明讲师鉴定为茜草科茜草属钩藤Uncaria rhynchophylla (Miq.) Jacks, 本实验均用钩藤的药用部位藤茎进行实验。

　　2、 实验方法

　　2.1、 高效毛细管电泳条件

　　毛细管:75μm×60 cm的熔融石英毛细管柱, 有效长度为51.8 cm (河北永年锐沣色谱件有限公司) ;DAD检测器, 检测波长245 nm;以50 mmol·L-1, p H=6.5的醋酸铵-甲醇溶液作为缓冲液;工作电压15k V;压力进样:5 k Pa×10 s, 电解质封口:2 k Pa×5 s;柱温15℃;进样前分别用甲醇、缓冲液冲柱20 min。在此条件下, 样品中钩藤碱电泳峰与其他杂峰基线完全分离, 结果见图1~2。

　　图1 钩藤供试品溶液加钩藤碱对照品前电泳图

　　注:a内标物二苯呱b钩藤碱

　　图2 钩藤供试品溶液加钩藤碱对照品后电泳图

 

　　注:a内标物二苯呱, b钩藤碱

　　2.2、 溶液的制备

　　2.2.1、 对照品溶液的制备

　　精密称取钩藤碱对照品3.03 mg用1%盐酸甲醇定容于25 m L容量瓶中, 即得浓度为121.20μg·m L-1的对照品溶液。

　　2.2.2、 内标二苯胍溶液的制备

　　精密称取二苯胍196.78 mg置于500 m L容量瓶中, 加入适量1%的盐酸甲醇超声5 min, 冷却后用1%盐酸甲醇定容至刻度, 用0.22μm微孔滤膜过滤即得浓度为393.56μg·m L-1二苯胍内标溶液。

　　2.2.3 供试品溶液的制备

　　精密称取钩藤药材粉末约5 g置于100 m L锥形瓶中, 精密加入氯仿-甲醇-浓氨水 (15∶5∶1) 50 m L, 超声10 min, 静置2 h后, 再超声45 min, 滤过, 滤液置于蒸发皿中, 同法超声3次, 合并滤液, 于60℃水浴锅上蒸干滤液, 残渣用1%盐酸甲醇溶解, 精密加入“2.3.2”项下制备的内标液1 m L, 用1%盐酸甲醇定容于10 m L容量瓶中, 用0.22μm微孔滤膜过滤即得供试液。

　　3、 结果与讨论

　　3.1、 线性关系考察

　　分别精密吸取浓度为121.20μg·m L-1钩藤碱对照品0.2、0.5、0.8、1.0、2.0、2.5、6.0 m L和浓度为393.56μg·m L-1的二苯胍内标液1.0 m L置于7个10 m L容量瓶中, 用1%盐酸甲醇定容至刻度, 摇匀, 得一浓度梯度的混合溶液。分别精密吸取各梯度混合溶液0.45 m L置于7个样品小瓶中, 用新的样品小瓶盖盖紧, 按2.1项下的“电泳条件”进行电泳分离测定。用钩藤碱峰面积与二苯胍内标物峰面积之比 (Y) 为纵坐标, 浓度 (X) 为横坐标进行回归计算, 得回归方程:Y=2.8441X, r=0.9996。结果表明当二苯胍内标溶液的浓度为39.36μg·m L-1时, 钩藤碱在2.42~72.72μg·m L-1范围内线性关系良好。

　　3.2、 精密度试验

　　精密吸取浓度为363.60μg·m L-1的钩藤碱对照品溶液 (内含浓度为39.36μg·m L-1二苯胍内标物) 0.45 m L置于样品小瓶中, 用新的样品小瓶盖盖紧, 按2.1项下的“电泳条件”分别进样6次, 用钩藤碱的峰面积和内标物二苯胍峰面积之比计算RSD为2.02%, 表明该方法精密度良好。

　　3.3、 稳定性试验

　　取按2.2.3项下制备供试品溶液, 在0、4、8、12、16、20 h分别按2.1项下的“电泳条件”进行电泳分离测定, 用钩藤碱的峰面积和内标物二苯胍峰面积之比计算RSD为1.07%;结果表明钩藤碱在20 h内稳定。

　　3.4、 重复性试验

　　精密称取钩藤药材粉末样品6份, 每份约5 g, 分别置于100 m L锥形瓶中, 按2.2.3项下“供试品溶液的制备”方法制备供试液, 按2.1项下的“电泳条件”进行分离测定, 结果RSD为2.12%, 该样品中钩藤碱的平均含量为52μg·g-1。

　　3.5、 加样回收率试验

　　精密称取已知平均含量为52μg·g-1的钩藤药材粉末样品6份, 每份约2.50 g, 分别置于100 m L锥形瓶中, 加入一定量钩藤碱对照品按2.2.3项下“供试品溶液的制备”方法制备供试液, 分别精密吸取各供试液0.45 m L于6个样品小瓶中, 用新的样品小瓶盖盖紧, 按2.1项下的“电泳条件”进行电泳分离测定, 计算得平均回收率为97.74%, RSD为1.35%, 说明该方法能够较准确地测定钩藤中的钩藤碱含量。结果见表1。

　　表1 回收率实验

　　3.6、 样品含量测定

　　精密称取各钩藤药材粉末样品约5 g, 分别置于100 m L锥形瓶中, 按2.2.3项下“供试品溶液的制备”方法制备供试液, 按2.1项下的“电泳条件”进行分离测定, 结果见表2。

　　表2 钩藤药材中钩藤碱含量测定结果 (n=3)

 

　　4、 讨论

　　在建立钩藤药材中钩藤碱的电泳分离条件的实验过程中, 对于缓冲液的选择, 我们曾考察了p H为4.5~8.0, 浓度为50 mmol·L-1的醋酸铵-甲醇体系、p H为6.0~9.5, 浓度为60 mmol·L-1醋酸铵甲醇-乙腈 (1∶1) 体系、p H为6.50, 浓度为30~60 mmol·L-1硼砂体系, 最终确定分离效果较好且电流较为稳定, p H为6.5、浓度为50 mmol·L-1的醋酸铵-甲醇缓冲液为本实验的电泳缓冲液。

　　根据内标物的选择原则, 我们曾试验了多种化学试剂, 二苯胍在本实验条件下结果较为理想, 因此本实验选择了二苯胍作为内标物。

　　根据测定结果[2-3], 主要产于贵州或主要在贵州药材市场上流通的钩藤药材中的钩藤碱含量普遍较低, 有的甚至在该分析条件下未能检出, 而产于广西桂林的样品中钩藤碱含量却相对于贵州样品高数倍, 这是否与产地环境条件和种属不同有关。《中华人民共和国药典》2010版规定用于临床共有5个不同种的药用钩藤, 我们采集到的某些钩藤样品由于不易明确属哪个种, 因此钩藤中钩藤碱的含量与种的关系以及和地理环境的关系等是值得今后研究的问题。

　　参考文献：

　　[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典:一部[S].北京:化学工业出版社, 2010:240.
　　[2]杜昊忱, 周洪雷.RP-HPLC测定市售钩藤中钩藤碱的含量[J].辽宁中医杂志, 2010, 37 (10) :1996-1997.
　　[3]仲崇林, 赵为民.反相高效液相色谱法测定植物钩藤中钩藤碱含量[J].化学应用, 2006, 23 (9) :1061-1062.

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