摘要：目的 探讨p-mTOR在Luminal A型与Luminal B型乳腺癌中表达情况的差异， 并全面系统分析该蛋白表达与临床病理特征的关系及对预后的影响。方法 选取1999年1月至2008年12月间于北京协和医学院中国医学科学院肿瘤医院行乳腺癌根治术切除的211例有完整病理及生存资料的乳腺癌患者。采用组织芯片技术和免疫组化染色方法， 检测p-mTOR在75例Luminal A型乳腺癌患者和136例Luminal B型乳腺癌患者中的表达情况及其与临床病理特征和预后的关系。结果在Luminal A亚型乳腺癌中， p-mTOR表达阳性患者总共38例 （50.7%） , 其中p-mTOR胞浆着色结果与临床分期差异有统计学意义 （P=0.04） ;p-mTOR细胞核或核周着色结果与年龄差异有统计学意义 （P=0.03） .Kaplan-Meier生存分析显示p-mTOR总体阳性表达患者的无病生存时间更长， 差异有统计学意义 （P=0.01） .在Luminal B亚型中p-mTOR阳性表达患者共89例 （65.4%） .细胞核或核周着色结果与肿瘤直径和临床分期间差异均有统计学意义 （均P<0.05） , Kaplan-Meier生存分析显示核或核周着色阳性患者的无病生存时间低于阴性表达者， 差异有统计学意义 （P<0.01） , 经Cox多因素分析进一步证实核或核周着色结果是乳腺癌复发转移的独立预后因素 （P=0.01, HR=0.182, 95%CI 0.060~0.550） .结论 p-mTOR在乳腺癌不同亚型患者中的多样化表达特点提示不同的疾病行为及预后意义。p-mTOR作为Luminal B型乳腺癌的独立预后因素， 是潜在的有效靶点。

　　关键词：p-mTOR; 乳腺肿瘤； 免疫组化； 预后；

　　Abstract:Objective To explore the difference of p-mTOR expression level in luminal A and luminal B breast cancer, and comprehensively and systematically analyze the correlations of the protein expression with clinical pathological features as well as prognosis. Methods Two hundred and eleven patients with complete pathological and survival data and who received radical mastectomy at Cancer Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences, Peking Union Medical College were selected between January 1999 to December 2008. Tissue microarray and immunohistochemistry staining method were used to assess p-mTOR expression features in 75 luminal A patients and 136 luminal B patients and the association with pathological characteristics and outcomes. Results p-mTOR was positive in a total of 38 patients （ 50. 7%） for the luminal A subtype and cytoplasmic p-mTOR was correlated with clinical stage （ P = 0. 04） . Cytoplasmic pmTOR in the nucleus and perinuclear area was correlated with different ages （ P = 0. 03） . Kaplan-Meier analysis revealed that patients with positive p-mTOR expression had longer disease-free survival time （ P =0. 01） . In luminal B subtype, 89 patients （ 65. 4%） were found to have positive p-mTOR. Kaplan-Meier analysis revealed that there was significant difference in staining in the nuclear or perinuclear region, tumor diameter and clinical stage between the two groups （ all P < 0. 05） . Patients with positive expression in the nuclear or perinuclear area tended to have an shorter disease-free surviva than patients with negativel expression （ P < 0. 05） . It was further demonstrated in a multivariable Cox analysis that staining results in the nuclear or perinuclear region staining was an independent predictor for recurrence and metastasis of brest cancer （ P = 0. 01, HR = 0. 0182, 95% CI 0. 060-0. 550） . Conclusion The variable staining patterns of pmTOR in different subtypes of breast cancer indicat different disease behaviors and prognosis. As an independent prognostic factor for luminal B subtype, p-mTOR was a potentially effective target.

　　Keyword:p-mTOR; Breast neoplasms; Immunohistochemistry; Prognosis;

　　Phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B/mammalian target of Rapamycin （PI3K/Akt/m TOR） 信号传导通路是一条复杂的细胞内信号通路， 参与调控肿瘤细胞的存活、增生、自噬及细胞周期进展等多种生物学进程。该通路的异常激活及通路上相关基因的异常表达有助于乳腺癌的发生和发展[1].m TOR是一种丝苏氨酸激酶， 作为PI3K通路下游的关键调控位点， 当其受到上游信号分子刺激后， 磷酸化激活转变成phosphorylated-m TOR （pm TOR） , 最终导致蛋白合成增加及促进肿瘤细胞增殖、生长、分化及迁移[2].体内外实验均证实m TOR抑制剂及其衍生物能够抑制包括乳腺癌在内多种肿瘤细胞的生长， 是一个潜在的有效靶点[3,4].自2011年St.Gallen国际乳腺癌会议以来， 在依据免疫组化检测雌激素受体 （estrogen receptor, ER） 、孕激素受体 （progestrone receptor, PR） 、人类表皮生长因子受体II （human epidermal growth factor receptor II, HER2） 水平基础之上， 加入ki-67作为乳腺癌分子分型的标准， 并以ki-67增殖指数14%作为luminal A型和Luminal B型的分界线[5].近年来， 有研究指出虽然两种亚型同属于管腔型 （Luminal） 乳腺癌， 但是与Luminal A型相比， Luminal B型乳腺癌生物学行为更为复杂， 侵袭性更强以及预后较差[6,7].目前， 国内关于p-m TOR不同着色部位表达的临床意义的研究报道罕见， 而根据新分型标准评估p-m TOR在乳腺癌这两种亚型中表达情况及预后的研究尚无。本研究通过系统全面分析p-m TOR在Luminal A与Luminal B亚型中表达情况的差异及对预后的影响， 以期为乳腺癌个体化靶向治疗提供理论依据。

　　资料与方法

　　1.一般资料：选取1999年1月至2008年12月间于中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院行乳腺癌根治术切除的211例有完整病理及生存资料的女性乳腺癌患者。其中， 浸润性导管癌189例 （组织学分级为G1 15例， G2 121例， G3 53例） , 浸润性小叶癌11例， 其它特殊类型11例 （黏液癌8例， 化生性癌1例， 浸润性筛状癌2例） .纳入标准： （1） 通过HE切片及免疫组化结果复阅， 符合Luminal型乳腺癌特点； （2） 患者术前均未经过任何治疗且无乳腺癌及卵巢癌家族史。切片复阅由本院2位高年资病理医师完成。综合Ki-67判读结果， 进一步将患者分为Luminal A型乳腺癌75例， Luminal B型乳腺癌136例， 患者临床病理信息包括年龄， 肿瘤直径、分级 （根据2012年WHO乳腺癌标准进行分级， 只对浸润性导管癌进行组织学分级） , 淋巴结转移， 脉管瘤栓， 月经状态和临床分期。患者术前均未经任何治疗且无乳腺癌及卵巢癌家族史。所有患者随访资料完整， 无病生存期从手术之日计算， 终止日期为患者出现复发、转移日期或末次随访日。截止日期为2014年8月24日， 随访期限为7~185个月不等， 中位生存时间为77个月。

　　2.实验方法及所用抗体： （1） 组织微阵列技术 （tissue microarray, TMA） , 即制备组织芯片。本研究用1mm的打孔针从每个标本取组织芯3处 （癌组织2处， 正常乳腺组织1处） . （2） 免疫组织化学染色采用En Vision两部法。主要步骤包括：二甲苯脱蜡， 抗原修复采用高压热修复， 3%H2O2用于阻断内源性过氧化物酶， 一抗和二抗室温孵育时间分别为1.5h和15min, DAB显色按试剂盒操作说明进行。实验中以磷酸盐缓冲液 （PBS） 代替一抗作阴性对照， 用已知阳性片作阳性对照。 （3） 所用抗体：兔抗人p-m TOR （Ser 2448） 单克隆抗体购自美国Cell Signaling Technology （CST） 公司 （稀释度1:100, 修复液为枸橼酸钠p H 6.0） .鼠抗人Ki-67单克隆抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司 （工作液， 修复液为EDTA p H 9.0） ;二抗、EDTA和DAB显色剂购自Dako公司， 枸橼酸钠购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

　　3.分子分型：依据2011年St.Gallen共识， 管腔型 （Luminal） 乳腺癌具体分为Luminal A型和Luminal B型， Luminal A型：ER和 （或） PR阳性， HER2阴性， Ki-67<14%;Luminal B型： （1） ER和 （或） PR阳性， HER2阴性， Ki-67≥14%; （2） ER和 （或） PR阳性， HER2阳性， 任何Ki-67.

　　4.结果判定：ER和PR阳性标准定义为肿瘤细胞核染色≥1%;Ki-67阳性表达定位于细胞核 （<14%, 低表达；≥14%, 高表达） ;HER2阳性判读依据《乳腺癌HER2检测指南2014版》；p-m TOR评分标准结合肿瘤细胞阳性比例及染色强度[8].0 （阴性） :无着色；+ （低表达） :5~50%肿瘤细胞呈弱阳表达或1%~10%肿瘤细胞呈中至强阳表达；++ （高表达） :>50%肿瘤细胞呈弱阳表达或>10%肿瘤细胞呈中至强阳表达。

　　5.统计学方法：采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析。计数资料的比较采用x2检验， 生存分析采用Kaplan-Meier方法， 采用Log-rank法进行显著性检验， 多因素分析采用Cox比例风险回归模型， 以P<0.05为差异有统计学意义。

　　结果

　　1.p-m TOR在Luminal A亚型中的表达特点及与临床病理特征的关系：p-m TOR阳性部位呈现为细胞浆、细胞核及核周区域三种形态 （图1） .在Luminal A型乳腺癌患者中该蛋白表达总共38例 （50.7%） , 其中细胞浆阳性24例 （32.0%） , 细胞核或核周区域阳性14例 （18.7%, 细胞核1例， 核周区域13例） .p-m TOR总体阳性表达结果与各项临床病理参数间差异无统计学意义 （P>0.05） , "胞浆着色阳性"患者在临床早期 （1和2期） 表达率高于临床进展期 （3期） , 差异有统计学意义 （37.9%vs 11.8%, P=0.04） .此外， "细胞核或核周着色阳性"患者在年龄<50岁患者中的表达率高于年龄≥50岁的患者， 差异有统计学意义 （28.2%vs 8.3%, P=0.03, 表1） .

　　表1 Luminal A亚型乳腺癌患者临床病理特征与p-m TOR表达水平的关系[例 （%） ]

　　注：其他类型包括：粘液癌、化生性癌和浸润性筛状癌

　　图1 ki-67和p-m TOR在乳腺癌组织中免疫组化的表达 （×400） A:ki-67阳性表达；B:ki-67表达的阴性对照；C:pm TOR细胞浆阳性表达；D:p-m TOR细胞核阳性表达；E:p-m TOR核周区域阳性表达；F:p-m TOR表达的阴性对照

　　2.p-m TOR在Luminal B亚型中的表达特点及与临床病理特征的关系：p-m TOR在Luminal B中的着色部位与Luminal A一致 （图1） .其阳性表达共89例 （65.4%） , 包括细胞浆阳性58例 （42.6%） , 细胞核或核周区域阳性31例 （22.8%, 细胞核5例， 核周区域26例） .p-m TOR总体阳性表达结果和胞浆着色阳性表达结果与各项临床病理参数间差异均无统计学意义 （均P>0.05） .p-m TOR细胞核或核周着色阳性表达在肿瘤>2cm患者的表达率高于肿瘤≤2cm的患者， 在临床分期1~2期的表达率高于临床3期， 差异均有统计学意义 （均P<0.05, 表2） .

　　3.p-m TOR的表达与预后相关性分析：在Luminal A型乳腺癌中， Kaplan-Meier生存分析显示pm TOR总体阳性表达患者的无病生存时间 （diseasefree survival, DFS） 高于阴性表达患者， 经Log-rank检验两组差异有统计学意义 （P=0.01） .在Luminal B型乳腺癌中， "p-m TOR总体阳性表达患者与预后间差异无统计学意义 （P>0.05） , Kaplan-Meier生存分析显示"细胞核或核周着色阳性"患者DFS显著低于阴性表达患者， 并且Log-rank检验两组差异有统计学意义 （P<0.01） .对经过筛选的影响乳腺癌预后的临床病理因素 （肿瘤大小、淋巴结转移、临床分期和核或核周蛋白表达） 行Cox多因素分析， 证实细胞核或核周着色阳性表达是Luminal B型乳腺癌复发转移的独立预后因素 （P=0.01, HR0.182, 95%CI 0.060~0.550） .

　　表2 Luminal B亚型乳腺癌患者临床病理特征与p-m TOR表达水平的关系

　　注：其他类型包括：黏液癌、化生性癌和浸润性筛状癌

　　讨论

　　过去多数关于p-m TOR表达情况的研究只提及细胞浆阳性定位， 而忽视其它着色部位[9,10,11].我们的研究发现p-m TOR表达主要呈现细胞浆阳性， 部分病例可呈细胞核或核周区域着色， 并且不同着色部位提示不同临床意义。与Ueng等[8]染色判读结果一致， 我们发现p-m TOR在高表达与低表达组间表达的差异无统计学意义， 因此最终按阳性或阴性进行统计学分析。p-m TOR表达 （胞浆） 在Luminal型乳腺癌中的预后好， 并与肿瘤直径较小 （<2cm） 和分级低相关[9].同样， 本研究中p-m TOR"胞浆着色阳性"和"细胞核或核周着色阳性"患者的预后较好， 并与临床早期及年龄较小 （<50岁） 有关， 差异有统计学意义 （P<0.05） .有研究发现早期乳腺癌患者伴有p-m TOR表达者局部复发风险低， 但是缺乏不同分子分型与复发风险的关系[12].有研究证实在Luminal型乳腺癌中蛋白表达阳性患者的DFS和总生存时间更长， 但是没有具体分为Luminal A与Luminal B两种亚型后进行生存分析比较[9].本研究将Luminal分为Luminal A与Luminal B亚型， 发现在Luminal A亚型中p-m TOR表达阳性者DFS高于阴性表达者， 差异有统计学意义 （P<0.05） .由此我们认为该蛋白在Luminal A亚型中不同着色部位的表达与相对较好的疾病行为有关， 并且蛋白整体阳性表达提示预后较好。

　　与Luminal A相比， p-m TOR在Luminal B亚型中的表达与不良疾病行为相关。我们实验结果表明"细胞核或核周着色阳性"与肿瘤较大 （>2cm） 及临床进展期 （3期） 有关， 差异有统计学意义 （P<0.05） .因此我们认为核周区域着色对Luminal B型乳腺癌发生发展发挥着重要作用。另外， 细胞核着色表达的5例均属于临床进展期。有文献曾报道定位于细胞核的p-m TOR表达可以介导细胞r DNA和t DNA的转录， 对于蛋白合成发挥重要作用， 并且通过作用于呈现p-m TOR核阳性定位这种特殊表达方式的乳腺癌细胞株可以促进肿瘤细胞增生[13,14].Walsh等[15]通过比较p-m TOR在三阴与非三阴性乳腺癌中表达情况差异， 发现核着色形态在三阴性乳腺癌中的阳性表达率高于非三阴乳腺癌， 并与淋巴结转移相关， 而核周区域着色则主要集中在非三阴性乳腺癌， 这与我们Luminal型核周区域阳性表达率明显高于核阳性的结果一致。虽然Luminal型乳腺癌核阳性表达率较低， 但是该染色模式往往与较差病理特征相关， 代表一种侵袭性生物学行为。

　　Ki-67是与细胞增殖相关的核抗原， 它始于细胞周期的G1期， S期及G2期表达增强， 至M期达高峰， 在细胞分裂晚期很快降解消失[16].de Azambuja等[17]一篇包含12 155例早期乳腺癌患者的Meta分析发现Ki-67表达者复发风险率高， 生存时间短， 是乳腺癌预后的一个独立危险因素。HER-2/Cerb B2是具有酪氨酸激酶活性的原癌基因， 在乳腺癌中过表达提示肿瘤恶性程度高、易发生转移且预后差， 被作为乳腺癌预后判断的一项独立因子[18].本研究结果显示， Luminal A型乳腺癌p-m TOR阳性表达者的DFS比阴性表达者更长， 预后好。虽然Luminal B乳腺癌中， 该蛋白整体阳性表达与预后差异无统计学意义， 但是"细胞核或核周着色阳性"患者的DFS低于阴性表达者， 并经Cox多因素分析证实是Luminal B型乳腺癌复发转移的独立预后因素。由于Luminal B型乳腺癌具有HER-2阳性和Ki-67高表达等特点， 因此我们认为p-m TOR的表达在Luminal B中存在与Luminal A相反的预后影响， 且与不同亚型中相关基因表达水平 （例如HER-2和Ki-67等） 有重要关系。此外， 有研究发现Luminal B肿瘤ER表达水平相对较低， 并常伴有GFR/PI3K信号通路高度激活[19].PI3K通路靶向抑制剂的应用有希望改善患者ER低表达的状态并恢复对内分泌治疗的敏感性。在Luminal B亚型中， 相关基因的高度表达与活化后的信号通路相互作用是其与Luminal A型乳腺癌相比对内分泌治疗相对耐药、临床预后较差的重要因素。

　　依维莫司作为雷帕霉素的衍生物， 是美国食品药物管理局 （FDA） 唯一批准用于治疗激素受体阳性、HER-2阴性并伴有局部进展或出现远处转移乳腺癌患者的m TOR口服抑制剂[20].国内也有研究报道m TOR磷酸化表达状态是ER阳性乳腺癌复发转移的独立预后因素， 提示辅助内分泌治疗联合m TOR抑制剂可为ER阳性乳腺癌患者带来生存获益[21].在本研究p-m TOR免疫组化实验结果中， 该蛋白阳性表达率超过一半， 提示m TOR抑制剂在Luminal型乳腺癌中的潜在应用价值。原癌基因PIK3CA突变、抑癌基因PTEN丢失以及Akt异常活化是PI3K信号通路上的重要调控因素， 有学者指出乳腺癌患者伴有上述基因改变能够提高对m TOR抑制剂的敏感性[22].在今后的研究中， 我们应在乳腺癌分子分型的基础上进一步探究p-m TOR与信号通路上其它调节位点的相互作用， 为靶向药物研发提供新的理论依据。

　　综上所述， p-m TOR在乳腺癌中的阳性表达呈现多样化的特点， 虽然细胞浆是主要着色部位， 但是核周区域着色在Luminal型尤其是Luminal B型乳腺癌发生发展中发挥着重要作用。不同分子分型由于相关基因表达水平的差异， p-m TOR的表达往往会提示不同的生物学行为及预后影响。pm TOR作为Luminal B型乳腺癌独立的预后因子， 为个体化靶向治疗提供潜在有效的靶点。

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