摘    要：　目的 探讨寨卡病毒 (Zika Virus, ZIKV) 与不同血型红细胞的粘附作用。方法 选取A型、B型、O型及AB型全血各5 U, 离心后去除白膜层与血浆, 红细胞经生理盐水洗涤后重悬于等体积的同型血浆, 添加一定比例的寨卡病毒, 置37℃孵育箱孵育。3 d后, 分别留取各血液成分血样, 其中红细胞以生理盐水洗涤后重悬。抽提全血、红细胞以及血浆中的核酸并定量检测病毒载量。结果 所有血型的红细胞和血浆中均能够检测到载量>108 copies/mL的寨卡病毒RNA;且O型红细胞中的RNA拷贝数高于血浆, 差异具有显着性 (P<0.05) ;而AB型红细胞中的RNA拷贝数则显着低于血浆 (P<0.05) 。结论 寨卡病毒对红细胞具有一定的粘附作用, 且该作用在不同血型的红细胞间存在差异。

　　关键词：　血型; 红细胞; 寨卡病毒; 粘附;

　　Abstract：　Objective To investigate the adherence of Zika Virus (ZIKV) to different blood types of red blood cells. Methods Five units for each blood type of A, B, O and AB whole blood were selected. After centrifugation, buffy coat and plasma were removed, and red blood cells (RBCs) were suspended in plasma of the same type with the same volume. ZIKV suspension was added to the above samples in a certain proportion, and then mixed and incubated in an incubator at 37 ℃. Three days later, the whole blood samples and the upper plasma by centrifugation were collected detected for ZIKV RNA, and the RBCs were washed and resuspended with normal saline followed by viral load detection. Results ZIKV (> 108 copies/mL) was detected in all RBCs and plasma samples. ZIKV RNA quantification were significantly higher than those in plasma (P<0.05) in type O RBCs and lower than those in plasma (P<0.05) in type AB RBCs. Conclusion ZIKV adheres to erythrocyte, and the effect of adhesion is vary between RBCs of different blood types.

　　Keyword：　blood type; red blood cell; Zika virus; adherence;

　　寨卡病毒 (Zika virus, ZIKV) 是一种蚊虫传播的黄病毒。2016年2月, 因寨卡在中美、南美洲的暴发流行, 国际卫生组织WHO宣布将寨卡的流行认定为全球公共卫生突发事件[1]。

　　寨卡病毒的RNA可在感染者血浆中存在1-2周, 有意思的是最近的报道发现, 即使临床症状消失, 血浆中的寨卡病毒核酸检测转阴, 部分感染者仍能在症状出现后的5-101d从全血中检出 RNA[2-4]。初步研究显示这一现象与红细胞相关。有文献报道, 同为黄病毒属的登革病毒 (Dengue virus, DENV) 和西尼罗病毒 (West Nile virus, WNV) 也同样存在与红细胞粘附这一现象[5]。一项有关WNV的研究显示, 血型为A型的感染者全血中的WNV病毒载量高于O型感染者, 提示病毒与红细胞的结合可能与血型糖蛋白相关[6]。本研究拟探讨寨卡病毒与红细胞的粘附作用以及该作用是否与红细胞的血型相关。

　　1 、材料与方法

　　1.1、 寨卡病毒与血液标本

　　寨卡病毒 (上海市公共卫生临床中心复旦大学附属中山医院南院科研中心提供, 为国内临床分离株SZ01) ;随机领取的A型、B型、O型及AB型人全血各5U (上海市血液中心提供, 传染病规定项检测均为阴性, 寨卡病毒核酸检测为阴性) ;A型、B型、O型及AB型的多人份混合血浆各200mL (上海市血液中心提供, 传染病规定项检测均为阴性, 寨卡病毒核酸检测为阴性) 。
 

　　1.2 、仪器与试剂

　　CO2培养箱 ( Forma 3110, 美国Thermo) ;医用PVC 血袋 ( 上海输血技术有限公司, 100mL) ;TRIzol RNA抽提试剂 (Invitrogen, Thermo Fisher) ;pEASY-T5 Zero载体 (北京全式金生物技术有限公司) ;Spe I内切酶 (NEB) ;T7 Transcription Kit (Roche Diagnostics) ;DTT (0.1M, 上海生工) ;dNTPs (2.5mM, TAKARA) ;核糖核酸酶抑制剂 (40-200U/μL , TAKARA) ; AMV逆转录酶及缓冲液 (TAKARA) ;随机引物 (100μM, TAKARA) ;One Step PrimeScript RT-PCR Kit (TAKARA) ;7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems) ;紫外分光光度计 (Biophotometer 6132, Eppendorf) ;所有引物及探针均由TAKARA合成。

　　1.3、 全血样本的前处理

　　为减少在因标本自身血液环境不同可能带来的影响, 我们对全血样本进行了处理。将各血型血样3 500rpm离心20min (离心力2 465 g) , 吸取去除上层血浆和白膜层细胞, 并用生理盐水反复洗涤红细胞3次后, 加入等体积的同型混合血浆重悬红细胞作为样品的全血血样。以1∶10比例向血样加入寨卡病毒 (浓度为8.96×1011 copies/mL) , 混匀后置37℃孵箱中孵育, 根据前期的实验, 红细胞在37℃中孵育4d后开始出现轻微溶血, 因此本实验将孵育时间定为3 d。

　　1.4、 样品处理及病毒RNA抽提

　　上述标本孵育3d后, 离心分离出血浆和红细胞, 红细胞用生理盐水洗涤3次后, 以等体积的生理盐水重悬, 分别留取各组分的血样。将留存的去白细胞全血、同型血浆及洗涤红细胞样品各取200μL, 用TRIzol抽提病毒RNA, 溶解于DEPC水中, 保存于-80℃。

　　1.5、 寨卡病毒定量检测RNA标准品的制备

　　采用Oligo6.67软件针对寨卡病毒结构蛋白区基因设计克隆引物:上游引物:5′AGGCCATTTCGTTTGCTACCACA3′, 下游引物:5′GCCCTTCAATCTAAGCTTGTCCA3′。将克隆引物的1.3kbp扩增片段克隆于pEASY-T5 Zero载体构成重组质粒, 并经酶切鉴定及测序鉴定。重组质粒经Spe I酶切线性化后, 用T7 Transcription Kit体外转录为RNA。该RNA经纯化后, 采用紫外分光光度计测定其浓度, 换算成拷贝数后将其10倍梯度稀释至浓度为105-1011copies/mL的定量扩增标准品。

　　1.6、 寨卡病毒定量检测体系的建立

　　根据文献报道[7], 寨卡 RNA定量PCR扩增引物采用上游引物5′TCGTTGCCCAACACAAG3′, 下游引物5′CCACTAATGTTCTTTTGCAGACAT3′, 探针序列为:5′AGCCTACCTTGACAAGCAATCAGA3′。 采用One Step PrimeScript RT-PCR Kit反转录并定量扩增检测病毒RNA, 反应条件为:①42℃ 5min;②95℃ 10s;③95℃ 5s, 60℃ 45s, 共40个循环。定量PCR扩增反应由7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems) 完成。

　　1.7、 统计学分析

　　采用Microsoft Excel (version 2013) 对结果数据进行t检验统计分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2、 结果

　　2.1、 荧光定量PCR标准品的构建及定量检测体系的建立

　　重组质粒经体外转录制备的寨卡病毒定量扩增RNA标准品的扩增线性关系见图1。由线性回归分析可知, 该标准曲线的线性相关系数R2>0.99, 证明梯度稀释的体外转录RNA在扩增中与Ct值之间具有良好的线性关系, 可作为定量PCR的标准品。

　　2.2、 全血、血浆及红细胞中的病毒载量

　　上述各血型标本的去白细胞全血、同型血浆及洗涤红细胞样品中的RNA经抽提后, 采用定量PCR扩增体系进行逆转录及扩增反应, 以不含寨卡病毒的血液样本为阴性对照。扩增结果如下:结果显示, 所有血型的全血、血浆以及红细胞标本中均能够检测到寨卡病毒RNA, 其载量均在108 copies/mL以上;其中A型样品红细胞中的病毒载量与血浆相比有高有低, 无明显规律 (图2) 。B型与O型样本中, 红细胞中的病毒拷贝数均高于血浆 (图3、4) ;经t检验分析可知, O型红细胞的病毒载量与血浆之间有显着性差异 (t state为2.63, P<0.05) , 说明O型红细胞中的病毒量显着高于血浆 (表1) 。AB型样本则红细胞中的病毒载量均显着低于血浆 (t state为2.76, P<0.05) (图5、表1) 。

　　图1 寨卡病毒 RNA定量标准品的扩增线性关系图

　　注:图为体外转录RNA在10倍梯度稀释后, 经定量PCR扩增后的线性关系曲线;纵坐标为RNA含量的对数值, 其浓度为5.82×1011-5.82×104copies/mL;横坐标为定量扩增的Ct值;由回归分析可知, 其线性相关系数R2>0.99, 每个稀释度均检测3次

　　表1 4种血型样品各组分中的病毒载量均值以及t检验结果

　　图2 A型样品各组分中的病毒载量

　　图3 B型样品各组分中的病毒载量

　　图4 O型样品各组分中的病毒载量

　　图5 AB型样品各组分中的病毒载量

　　3、 讨论

　　寨卡病毒是一种蚊虫传播的黄病毒, 其传播媒介为埃及伊蚊和白纹伊蚊, 感染寨卡病毒后可能导致小头症和严重的神经系统疾病——吉兰—巴雷综合征 (Guillain-Barre syndrome, GBS) , 目前尚无特异性的病毒对症治疗措施。除蚊媒传播外, 寨卡病毒还可通过输血传播。早在2013-2014年法属波利尼西亚流行期间, 就已经发现2.8%的亚临床感染的献血者血浆中能检出寨卡病毒RNA[8];2016年在波多黎各进行寨卡病毒的RNA筛查结果同样表明, 1%的亚临床感染的献血者血浆中可检出寨卡病毒 RNA[8]。同时, 巴西也报道了3例可能通过输血传播寨卡的病例[9-11]。

　　最近的报道发现, 即使临床症状消失, 血浆中的寨卡病毒核酸检测结果转阴, 部分感染者仍能在症状出现后的5-101d从全血中检出寨卡病毒 RNA。有关WNV的研究显示, 血型为A型的感染者全血中的WNV病毒载量高于O型感染者, 提示病毒与红细胞的结合可能与血型糖蛋白相关或者被在A型红细胞上出现频率更高的分子所介导[6]。那么寨卡病毒与红细胞之间是否也存在这样的粘附关系?为了探究寨卡病毒与红细胞之间的粘附作用及其与血型之间是否存在联系, 我们进行了本研究。

　　研究发现, 在将病毒与红细胞孵育后, 我们反复洗涤了红细胞, 经检测, 仍有>108 copies/mL 的病毒RNA载量, 说明寨卡病毒确与红细胞存在一定程度的粘附作用。而同时, 寨卡病毒与不同血型的红细胞之间呈现出不同程度的亲和力:病毒与O型红细胞间存在较强的粘附, 与AB型的粘附最弱;这与已有的WNV病毒所呈现的规律不同, 可能与两种病毒侵染细胞的机制存在差异有关。

　　据报道, 在对寨卡病毒感染神经靶细胞的研究中, Tomasz J. Nowakowski 通过研究人胎大脑中的单细胞RNA表达谱, 发现细胞表面分子Axl的mRNA处于高表达水平[12]。Axl是TAM (Tyro3, Axl, Mer) 受体酪氨酸激酶家族中的一员。在血液中, 它们参与巨核细胞、NK 细胞和DC 细胞的分化, 调节止血和天然免疫。我们推测, 寨卡病毒可能通过细胞表面的TAM受体与红细胞结合[13]。而寨卡与TAM受体的结合模式以及TAM受体与血型之间的关系尚有待进一步的研究和阐释。

　　综上所述, 寨卡病毒与红细胞之间存在一定的粘附作用, 且该粘附作用在不同血型的红细胞间存在差异, 血型可能影响着病毒与红细胞之间的亲和性。我们将进一步探讨寨卡病毒与红细胞之间的相互作用及其内在机制, 该机制可能对输血传播病毒的预防和筛查策略及血液病原体灭活技术的研究具有重要指导意义。

　　参考文献

　　[1] Heymann DL, Hodgson A, Sall AA, et al.Zika virus and microcephaly:why is this situation a PHEIC?Lancet , 2016, 387 (10020) :719-721.DOI:10.1016/S0140-6736 (16) 00320-2
　　[2] Murray KO, Gorchakov R, Carlson AR, et al.Prolonged Detection of Zika Virus in Vaginal Secretions and Whole Blood.Emerg Infect Dis, 2017 23 (1) :99-101.doi:10.3201/eid2301.161394.Epub 2017 Jan 15.
　　[3] Foeschl G, Huber K, von Sonnenburg F, et al.Long-term kinetics of Zika virus RNA and antibodies in body fluids of a vasectomized traveller returning from Martinique:a case report.FBMC Infect Dis.2017, 17 (1) :55-63, doi:10.1186/s12879-016-2123-9.
　　[4] Lustig Y, Mendelson E, Paran N, et al.Detection of Zika virus RNA in whole blood of imported Zika virus disease cases up to 2 months after symptom onset, Israel, December 2015 to April 2016.Euro Surveill.2016, 21 (26) :1-4.Doi:10.2807/1560-7917.ES.2016.21.26.30269.
　　[5] Rios M, Daniel S, Chancey C, et al.West Nile virus adheres to human red blood cells in whole blood.Clin Infect Dis, 2007, 45 (2) :181-186.
　　[6] Lanteri MC, Lee TH, Wen L, et al.West Nile virus nucleic acid persistence in whole blood months after clearance in plasma:implication for transfusion and transplantation safety.Transfusion, 2014, 54 (12) :3232-3241.doi:10.1111/trf.12764.
　　[7] Lanciotti RS, Kosoy OL, Laven JJ, et al.Genetic and serologic properties of Zika Virus associated with an epidemic, yap state, Micronesia, 2007.Emerging Infectious Diseases, 2008, 14 (8) :1232-1239.
　　[8] Musso D, Nhan T, Robin E, et al.Potential for Zika virus transmission through blood transfusion demonstrated during an outbreak in French Polynesia, November 2013 to February 2014.Euro Surveill, 2014, 19 (14) :1-3.pii:20761
　　[9] European Centre for Disease Prevention and Control.Rapid risk assessment:Zika virus epidemic in the Americas:potential association with microcephaly and Guillain-Barré syndrome (first update) .Stockholm:ECDC, 2016
　　[10] Motta IJ, Spencer BR, Cordeiro da Silva SG, et al.Evidence for Transmission of Zika Virus by Platelet Transfusion.N Engl J Med, 2016, 375 (11) :1101-1103
　　[11] Barjas-Castro ML, Angerami RN, Cunha MS, et al.Probable transfusion-transmitted Zika virus in Brazil.Transfusion 2016, 56 (7) :1684-1688.
　　[12] Nowakowski TJ, Pollen AA, Di Lullo E, et al.Expression analysis highlights AXL as a candidate Zika virus entry receptor in neural stem cells.Cell Stem Cell.2016, 18 (5) :591-596.doi:10.1016/j.stem.2016.03.012.
　　[13] Hamel R, Dejarnac O, Wichit S, et al.Biology of Zika Virus Infection in Human Skin Cells.J Virol, 2015, 89 (17) :8880-8896.doi:10.1128/JVI.00354-15.

TAG标签： 血型     红细胞     寨卡病毒