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臭氧对肾脏缺血-再灌注损伤后纤维化的保护

发布时间:2019-09-29


  肾移植作为终末期肾脏疾病患者的理想治疗方案之一,已挽救了无数患者的生命,改善了其生活质量,但移植肾缺血-再灌注损伤(ischemic and reper-fusion injury,IRI)造成的肾脏慢性纤维化改变,是影响移植物长期存活的主要因素之一。因此如何减轻移植肾缺血-再灌注损伤后的纤维化过程,成为了国内外众多学者的关心问题。据相关文献报道,臭氧可以减轻肾脏缺血-再灌注损伤后的组织细胞凋亡和炎 症反应[1],其机制可能与低氧诱导 因 子-α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)[2]等 多 种 因素有关,但臭氧对缺血-再灌注后的肾纤维化过程是否具有保护作用,目前少有文献报道,本研究欲探讨臭氧预处理对肾脏缺血-再灌注损伤后的纤维化是否具有保护作用及其相关机制。

  1材料与方法

  1.1模型的建立与分组 从武汉大学实验动物中心购买Wistar大鼠24只,雄性,8周龄,体重在220-270g之间,随机分为3组,每组8只。假手术组(Sham组):以45mg/kg戊巴比妥钠腹腔麻醉后,取腹部正中切口游离双侧肾脏,切除右肾后缝合腹壁;缺血-再灌注组(IRI组):麻醉后取腹部正中切口游离双侧肾脏,切除右肾,将左肾动、静脉夹闭45min后开通,再灌注8周;臭氧预处理组(OzoneOP组):术前15d对该组大鼠经直肠吹入氧气和臭氧的混合气体5.0-5.5ml[臭氧浓度为50mg/L,1.0mg/(kg·d)],其余处理同缺血-再灌注组。

  1.2主要试剂及仪器 臭氧发生仪(YKS1000)由珠海依科医疗器械有限公司提供,α-SMA、TGF-β1和Smad7单克隆抗体购自Santa Cruz公司,BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物技术研究所。

  1.3样本采集及处理 模型建立8周后,经大鼠下腔静脉采血测定血肌酐(Cr)及血尿素氮(BUN)水平。再以颈椎脱臼法处死各组大鼠,取出肾脏,一部分肾脏组织保存于液氮中用于后续检测,另一部分以4%多聚甲醛溶液固定,常规石蜡包埋,用于制作病理切片。

  1.4观察指标

  1.4.1肾 功 能 Olympus全 自 动 生 化 分 析 仪(Au2700)测定各组大鼠血Cr及血BUN含量。

  1.4.2肾组织病理学检查 取出各组大鼠石蜡包埋肾组织标本,按标准步骤制成组织HE染色切片,将其置于光镜下观察组织病理改变,并拍片。

  1.4.3 Realtime-PCR 检测肾组织中α-SMA、TGF-β1和Smad7mRNA的含量取部分液氮中保存的各组大鼠肾组织,常规TRIzol试剂抽提总RNA,DEPC水溶解沉淀,核酸蛋白分析仪测定RNA浓度。取总RNA 1μg,逆转录生成cDNA.TGF-β1上 游 引 物:5′-CTTTAGGAAGGACCTGGGTTG-3′, 下 游 引 物:5′-GGTTGTGTTGGTTG-TAGAGGG-3′,扩增产物为140bp;Smad7上游引物:5′-GGCTTTCAGATTCCCAACTTC-3′,下游引物:5′-CGCCATCCACTTCCCTTGT-3′,扩 增 产 物为255bp;α-SMA上游引物:5′-CAACCCCTATA-CAACCATCACAC-3′,下游引物:5′-CCCAAACT-GCTTGCGTAACC-3′,扩增产物为142bp;内参β-actin上游引物5′-TGCTATGTTGCCCTAGACT-TCG-3′,下游引物5′-GTTGGCATAGAGGTCTT-TACGG-3′,扩增产物为240bp.PCR反应条件均为:94℃预变性5min,94℃变性30s,58℃退火30s,72℃延伸1min,共扩增35个循环;最后一次为72℃延伸7min.结果以目的基因与β-actin的比值表示。

  1.4.4 Western blot 检测肾组织中α-SMA、TGF-β1和Smad7的含量取液氮中保存的各组大鼠肾组织提取蛋白,按BCA试剂盒说明测定蛋白浓度,40μg蛋白上样,10%聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳,分离出待检测蛋白后电转,脱脂牛奶室温下封闭2h,TBST漂洗10min×3次,分别加入α-SMA、TGF-β1和Smad7抗体(1∶1 000),4℃过夜,再次TBST漂洗10min×3次,加入二抗(1∶2 000),室温下孵育1h,TBST漂洗10 min×3次,洗 膜后ECL法显色、照相。

  1.5统计学方法 SPSS 17.0软件对实验数据进行统计学分析,实验数据用均数±标准差表示,采用方差分析,以P<0.05表示差异有统计学意义。

  2结果

  2.1各组大鼠血Cr及血BUN含量各组大鼠的血Cr及血BUN检测结果相比,差异无统计学意义(P>0.05,见表1)。

  2.2各组大鼠病理切片镜检结果光镜下,Sham组肾组织结构近似正常,未见明显改变,缺血-再灌注组肾组织结构破坏明显,表现为近曲小管上皮细胞坏死,炎性细胞浸润,可见管型,损伤累及近曲小管三段所有细胞。OzoneOP组肾组织损伤明显轻于IRI组,表现为部分近曲小管细胞轻度水肿,偶见近曲小管近端坏死,偶见管型(见图1)。

  2.3 Realtime PCR检测各组大鼠α-SMA、TGF-β1和Smad7的mRNA含量与Sham相比,IRI组及OzoneOP组的α-SMA、TGF-β1的mRNA水平明显增高,而Smad7的mRNA水平显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。OzoneOP组较IRI组而言,α-SMA、TGF-β1的mRNA水平明显降低,Smad7的mRNA水平 明 显 增 高,差 异 有 统 计 学 意 义 (P<0.05)(见图2)。

  2.4 Western blot检测各组大鼠α-SMA、TGF-β1和Smad7的蛋白表达水平与Sham组相比,IRI组及OzoneOP组的α-SMA和TGF-β1的表达水平增高,Smad7的表达明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。OzoneOP较IRI组而言,α-SMA和TGF-β1的表达明显降低,Smad7的表达明显增高,差异有统计学意义(P<0.05)(见图3)。

  3讨论

  肾移植是终末期肾病治疗的理想方案,与透析治疗相比,肾移植具有康复率更高,受者存活时间更长等优点[3].而缺血-再灌注损伤是影响肾移植患者预后的一个重大因素,它可以促进慢性移植肾肾病(chronic allograft nephropathy,CAN)的发展[4],导致移植肾纤维化,最终造成肾移植的失败,而这个过程 与TGF-β1/Smad信 号 通 路 的 激 活 密 切 相关[5,6],现今研究认为,TGF-β1可与靶细胞的TGF-β1受体Ⅱ结合,导致TGF-βⅠ型受体的磷酸化,进而使TGF-β转移至TGF-βⅠ型受体上,形成配体-Ⅱ型受体-Ⅰ型受体复合物,进而磷酸化激活下游受体调节型Smads及通用型Smads,使其联合形成转录复合物,转录复合物进入细胞核内后调控如Pal-1等相关靶基因来影响靶细胞的增殖、分化、黏附、转移和凋亡,引起肾小管上皮细胞间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT),导致成肌纤维细胞增多及细胞外基质(extracellular matrix,ECM)沉积,最终导致肾小管间质纤维化[7,8].在这个过程中肌成纤维细胞的特异性标志α-SMA表达明显增多。

  Smad7作为该信号通路的抑制因子,能与活化的TGF-βⅠ型受体结合,阻止该通路下游受体调节型Smads等的磷酸化,负反馈调节TGF-β1对靶基因的转录[9,10],从而使EMT和ECM减少,最终减轻肾缺血-再灌注损伤所致的肾纤维化。

  医用臭氧在临床上应用已有100多年的历史,如今已在治疗腰椎间盘突出症、下肢缺血性疾病、口腔疾病等方面取得了一定的成效[11],相关实验研究已证实臭氧可以减轻大鼠肾的缺血-再灌注损伤后的炎症反应[1],但对缺血后的肾纤维化改变是否具有保护作用,目前少有报道。本实验建立大鼠肾脏缺血-再灌注损伤后纤维化模型,并予以臭氧预处理,对相关指标进行检测,结果显示各组大鼠肾功能指标未见明显差异。光镜下观察各组肾组织切片发现,较IRI组而言,OzoneOP组肾组织结构破坏程度明显减轻,提示臭氧预处理可以减轻大鼠缺血-再灌注肾脏的损伤,减轻肾纤维化程度。

  Realtime PCR及Western blot结果表明,臭氧预处理使缺血-再灌注大鼠肾组织中的a-SMA表达减少,提示肌成纤维细胞形成减少,而TGF-β1的表达明显降低,Smad7的表达明显增高,结合肾组织病理检查结果,考虑臭氧可能通过诱导Smad7的表达,从而抑制TGF-β1/Smad信号通路的传导,EMT和ECM生成减少,最终减轻肾缺血-再灌注后的损伤及纤维化程度,但其中确切机制仍需进一步研究证实。

  综上所述,臭氧预处理对大鼠肾脏缺血-再灌注后的纤维化有保护作用,其机制可能与影响肾组织TGF-β1、Smad7等的表达有关,这对研究移植肾缺血-再灌注后纤维化的防治方案具有重要的推动作用。

  参考文献

  [1]Chen H,Xing B,Liu X,et al.Ozone oxidative pre-conditioning inhibits inflammation and apoptosis in a ratmodel of renal ischemia/reperfusion injury[J].Eur JPharmacol,2008,581(3):306-314.

  [2] 王磊,刘修恒,陈晖,等。臭氧后处理对大鼠肾脏HIF-1α的表达及细胞凋亡的影响[J].武汉大学学报:医学版,2014,35(1):60-63.

  [3] 王祥慧。2013肾脏移植国际前沿热点及新进展---What's Hot?What's New?[J].实用器官移植电子杂志,2013,(4):202-204.

TAG标签: 缺血     灌注     臭氧    

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