【摘要】目的：检测朊蛋白（PrPc）在鼻咽癌组织中表达情况并分析结果与相应临床参数的相关性。方法：应用免疫组化法检测 PrPc在鼻咽癌及鼻咽部炎症组织表达差异,并分析其在鼻咽癌不同分化程度、年龄、性别、TNM 分期等临床病例资料之间的关系。结果：PrPc在鼻咽癌组织中的表达率为 30.0%（18/60）,鼻咽部炎症组织表达率为 8.3%（2/24），差异有统计学意义（χ2=4.436 P＜0.05）。在鼻咽癌 TNM 分期中阳性率随分化程度下降而升高（P＜0.05）。在 TNM 分期中朊蛋白在Ⅰ、Ⅱ期中表达率随分化程度降低而明显升高（P＜0.05），但在Ⅲ、Ⅳ 期间的差异则无统计学意义（P＞0.05），而在Ⅰ+Ⅱ期和Ⅲ+Ⅳ期的总体表达差异有统计学意义（P＜0.05）。PrPc在有无淋巴结转移，患者性别、年龄之间表达差异无统计学意义（P＞0.05）。结论：PrPc在鼻咽癌中高表达与鼻咽癌的临床分期、组织分化密切相关，能为鼻咽癌早期诊治提供帮助。

　　【关键词】朊蛋白；鼻咽癌；免疫组化

　　鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC），又名“广东癌”，是我国南方地区和亚洲东南部地区的常见肿瘤之一，其发病率和死亡率高居头颈部恶性肿瘤的榜首[1]。因其病灶位置隐蔽，早期临床症状不典型，大多数病例在发现时已处于肿瘤中晚期，多半已有颈部淋巴结转移，因此预后较差，死亡率较高。可见早期发现仍然是鼻咽癌有效防治的重中之重。

　　朊蛋白（prion protein ,PrPc）是一种细胞膜糖蛋白，分子量为 33KD-35KD，人类的 20 号染色体上可见有 PrP 表达，能够编码 253 个氨基酸[2]。朊蛋白具有很高的保守性，存在于机体大部分组织器官中。据研究报道，朊蛋白能参加信号的跨膜传导、细胞的粘附、铜离子的代谢过程，并且具有抗细胞凋亡及抗氧化应激作用。研究显示，在很多恶性肿瘤中均可检测到朊蛋白，并且发现其表达明显增高，例如：结肠癌[3-5]、胰腺癌[6-7]、胃癌[8-12]等。而有关朊蛋白与鼻咽癌关系的报道相对较少，本实验采用免疫组化法检测 PrPc在鼻咽癌中的表达情况，探讨 PrPc的表达水平与鼻咽癌临床病理特征的关系，期望为鼻咽癌的早期诊断及治疗提供参考。

　　1 材料与方法

　　1.1 一般资料

　　收集 2005 至 2015 年石河子大学医学院第一附属医院及石河子市人民医院明确诊断为原发鼻咽癌患者病例资料 60 例，其中男性 55 例，女性 5例，年龄 14～84 岁，平均年龄（52.1±15.1）岁。按2009 年国际抗癌联盟（UICC）TNM 临床分期：Ⅰ+Ⅱ期与Ⅲ+Ⅳ病例各为 36 及 24 例；转移与非转移病例为 43 及 17 例。同时收集鼻咽部正常粘膜组织 24 例，年龄 21～74 岁，平均年龄（48.6±9.7）岁，经 HE 染色证实为无病变组织。 标本常规福尔马林固定，石蜡包埋备用。（所有患者均已签订手术知情同意书，术前详细告知手术风险，并同意参加此项实验研究）。

　　1.2 主要试剂

　　朊蛋白 4H2 鼠抗人单克隆抗体由中国科学院武汉病毒研究所病毒学李朝阳实验室提供；相关试剂盒购于北京中杉金桥生物技术有限公司。

　　1.3 实验方法

　　采用免疫组化 Envision 法检测 PrPc在各组标本中的表达，将石蜡包埋的组织块以每张 4μm 连续切片、37℃温箱烤片后脱蜡、脱二甲苯、脱水；枸橼酸缓冲液（pH 6.0）微波修复 15min，自然冷却至室温后用 3%双氧水室温孵育 10min 以阻断内源性过氧化物酶，PBS 浸洗（5min×3 次）；每张切片滴加朊蛋白抗体于 4℃冰箱孵育过夜，PBS 浸洗（5min×3 次）；每张切片滴加 50μl 山羊抗小鼠 IgG 抗体-HRP 多聚体 Envision 工作液、于 37℃温箱孵育 30min，PBS 浸洗（5min×3 次）；加入 DAB 显色，自来水冲洗后用苏木素复染、酸酒精分化，经脱水、透明后用中性树胶封片，光学显微镜下观察 PrPc的表达情况。

　　1.4 结果判定

　　PrPc定位于细胞浆和（或）细胞核，背景清晰，间质无染色。以组织细胞浆、核呈棕黄色显色判定为阳性（+），不着色为阴性，每张片随意选取 10 个 200倍镜视野，每个视野计数 100 个肿瘤细胞，按着色强度分为五级分别计分：0、1、2、3、4 分；依据着色所占比例分为: 无着色 0 分、＜30%为 1 分、30%～59%为 2 分、60%～89%为 3 分、≥90%为 4 分; 然后将两组分值相加，得分为 0～2 分视为弱阳性或者阴性（±）、3～4 分视为阳性（+）、＞4 分视为强阳性（++）。阳性率 =（强阳性组例数 + 阳性组例数）/ 总例数。所有染色图片结果均由医院两位病理学专家依据统一评分标准双盲判定评分。

　　1.5 统计学处理

　　运用 SPSS20.0 软件，选择卡方检验方法分析朊蛋白的表达强度与鼻咽癌患者临床参数之间的相关性，P＜0.05 为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 朊蛋白在鼻咽部正常组织及鼻咽癌组织中的表达情况

　　PrPc在鼻咽部正常组织中只有 2 例呈阳性表达，阳性表达率为 8.3%（2/24）；在鼻咽癌组织中主要定位于细胞质与细胞浆中，阳性表达率为 30%（18/60）明显高于鼻咽正常组织（χ2=4.436，P＜0.05）。

　　2.2 朊蛋白的表达强度与鼻咽癌相关

　　临床参数的关系（1）PrPc在高中分化、低分化鼻咽癌组织中的阳性表达率分别为 7.69%（1/13）、36.17%(17/47)；差异有统计学意义（P＜0.05）。（2）在 43 例有淋巴结转移的病例资料中，有 13 例阳性表达，17 例无淋巴结转移中 5 例阳性，两者间差异无统计学意义（P＞0.05），即朊蛋白的表达与有无淋巴结转移无相关(见表 1)。（3）TNM 分期：I 期 20 例、Ⅱ期 16 例、Ⅲ期 15 例、Ⅳ期 9 例，朊蛋白表达强度随 TNM 分期分级下降而增高，四期间的表达差异有统计学意义（P＜0.05）；朊蛋白在Ⅱ期鼻咽癌中的表达明显高于I期（P＜0.05）；同时在Ⅲ+Ⅳ期中的总体表达水平也明显高于 I+Ⅱ期（P＜0.05）。（4）朊蛋白的表达水平与鼻咽癌患者的年龄、性别无明显相关（P＜0.05）。

　　3 讨论

　　朊蛋白的生理功能并不十分清楚，目前已经得知的有：（1）朊蛋白对神经系统有保护作用，其能与铜离子结合起到避免神经细胞氧化的作用。（2）朊蛋白能够调节神经细胞胞内 Ca2+浓度，并参加 Ca2+的信号传导过程。（3）朊蛋白能够保持神经系统的功能，可以抑制脑内 r- 氨基丁酸（GABA）受体的兴奋性。因此一旦缺少朊蛋白，就会表现为震颤。（4）保护脑皮层浦肯野氏细胞的活力，避免机体发生共济失调。（5）朊蛋白 C 端结构可以促使免疫系统细胞成熟。（6）在核酸代谢中，朊蛋白也不可缺少。

　　朊蛋白存在于多数哺乳类动物体内，具有较高的保守性，如存在于脑皮质、胎盘组织、海马、丘脑等，这一类组织大多具有良好的延伸性和生长性。恰恰肿瘤的一个明显特征就是分化程度较低，生长性较强。

　　鼻咽癌在中国南方发病率较高，尤其是广东省是世界高发区，因此探讨中国人鼻咽癌恶性肿瘤的诊断对于提高对其治疗效果具有极其重要的临床意义。近几十年的研究证实 PrPc具有黏附分子特性，可以促进人类多种不同组织来源肿瘤的发生、转移，PrPc在各组织器官中广泛存在，在机体生理和病理状态下均发挥着重要的生物学功能。其不仅能拯救正常神经细胞，还能抑制肿瘤细胞对凋亡刺激的敏感性。本课题组前期利用免疫组化技术检测其在口腔鳞状细胞癌，粘膜白斑中的表达情况，结果表明，朊蛋白在粘膜白斑及口腔鳞状细胞癌中的表达差异有统计学意义(P＜0.05)，阳性率随分化程度下降而升高(P＜0.05)。朊蛋白的渐进性高表达可能与口腔鳞癌的发生发展有关[13]。因此推测 PrPc可能在鼻咽癌的发生发展中发挥重要作用，但 PrPc在鼻咽癌中的表达及临床意义尚未研究报道。

　　本研究中利用免疫组织化学法检测了朊蛋白在鼻咽癌组织中的表达情况。结果表明 PrPc在鼻咽癌组织中的表达明显高于鼻咽部炎症组织, 差异有统计学意义(P＜0.05)，然而朊蛋白在年龄、淋巴结转移间的差异均无统计学意义 (P＞0.05)。鼻咽癌大多数隐匿性生长，早期临床症状不明显，大多数伴有邻近侵犯或发生远处转移时才能被诊断。在肿瘤的TNM 分期中，朊蛋白在Ⅰ、Ⅱ期中表达率随分化程度降低而明显升高（P＜0.05），但在Ⅲ、Ⅳ期间的差异则无统计学意义（P＞0.05），而在Ⅰ+Ⅱ期和Ⅲ+Ⅳ期的总体表达差异有统计学意义（P＜0.05）。朊蛋白的高表达可能在鼻咽癌的发生发展中起到促进作用，但朊蛋白调控鼻咽癌的发生、发展的分子机制尚不明确，有待进一步研究证实。本课题组前期发现PrPc于口腔鳞癌中的阳性表达率为 95%（80/84）[13]，而其在鼻咽癌中的表达率为 30%（18/60），分析原因可能为：首先样本量偏小，其次可能与两种肿瘤致病因素相关。目前已经证实 EB 病毒的感染与鼻咽癌的发生发展密切相关，PrPc在鼻咽癌细胞中的表达是否受 EB 病毒感染的影响有待进一步研究，PrPc于恶性肿瘤中明显表达，其在肿瘤细胞中是否承担抗凋亡作用及广泛存在于细胞质中是否承担肿瘤细胞生长的某些功能，有待进一步研究。

　　参考文献：

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