中药学硕士论文范文第一篇：胆南星炮制前后成分变化及质量标准研究
　　
摘要

　　
　　胆南星（Arisaemacumbile）是天南星（ArisaematisRhizoma）的一种传统炮制品，苦寒、微辛，凉，具有清热化痰，息风定惊之功效。常用于痰热咳嗽，咯痰黄稠，痰迷中风，癫狂惊痫。2015年版《中国药典》记载的胆南星炮制方法为“以制天南星的细粉与牛、羊或猪胆汁经加工而成，或为生天南星的细粉与牛、羊或猪胆汁经发酵加工而成。”表明胆南星有两种炮制方法，一种采用发酵法，一种采用混合蒸制法。迄今，有关胆南星炮制的各方面研宄较少。发酵法和混合蒸制法制备的两种胆南星，制备过程中发生了哪些物质转化？其效应是否有差异？胆汁作为辅料其炮制作用为何？且目前尚未见有完善的胆南星的质量标准。因此，本论文在查阅资料与调研市场的基础上，研究了天南星经胆汁发酵炮制及混合法制胆南星前后成分及药效变化，同时对混合法制胆南星初步进行了质量标准控制方法的研究，主要研究内容总结如下：
　　
　　1.天南星及胆汁质量分析与成分研究
　　
　　按照《中国药典》2015年版天南星和制南星饮片项下的质量标准，收集符合要求的生天南星和制南星饮片。同时收集了江苏、安徽、浙江的猪、牛胆汁，与甘肃、内蒙的羊胆汁。首先测定猪、牛胆汁的pH、密度和固体量，作为初步控制胆汁质量的依据，测得12批次猪胆汁、10批次牛胆汁的pH平均值依次为6.641和7.046,相对密度为1.0388和1.0325,固体量平均值依次为11.44%和8.55%.采用HPLC法，建立了猪、牛和羊胆汁的指纹图谱。结果显示，猪、牛和羊胆汁色谱图分别有14、9和7个共有指纹峰，各相似度均大于0.92.分别以甘氨猪去氧胆酸（GHDCA）、牛磺胆酸（TCA）作为猪胆汁和牛、羊胆汁的参照物，方法学考察结果符合指纹图谱建立要求。并采用对照品归属了部分共有指纹峰。结果显示猪胆汁与牛、羊胆汁中胆汁酸类成分有显着差异。三者HPLC指纹图谱，特征性强、重复性好，可用于鉴别猪、牛、羊胆汁，控制胆汁质量。同时，采用液相色谱串联高分辨二级质谱（LC-HRMS/MS）对胆南星的原料生天南星及胆汁进行了成分组成研宄。
　　
　　（1）系统解析了天南星中主要的小分子有机物。利用软件peakview1.2的“‘Enhance'LC/MSPeak-FindingFilter”功能，设置阈值为最高丰度的2%,检索获得87个化合物；检索低于阈值的己知化合物5个；解析成分发现其中保留时间0.95-1.25min主要为小分子有机酸、硫酸化糖苷与扩基化糖苷；2-6min主要为核苷类成分；ll-20min主要为黄酮碳苷类成分；21-41min为长链脂肪酸及其衍生物。
　　
　　（2）系统比较了猪、牛和羊胆汁的胆汁酸类成分。结果显示，三种胆汁中胆汁酸类成分主要为牛磺酸和甘氨酸结合型胆汁酸；其母核主要为胆酸、脱氢胆酸、去氧胆酸和去氧脱氢胆酸；猪胆汁的胆汁酸类成分以猪胆酸系列为主，牛、羊胆汁的胆汁酸类成分以胆酸系列为主，并且猪胆汁比牛羊胆汁有更多的脱氢胆酸同分异构体，两者均含有鹅去氧胆酸系列胆汁酸。表明牛、羊胆汁中的胆汁酸类成分较为相近，而猪胆汁与牛、羊胆汁中的胆汁酸类成分存在显着差异。
　　
　　2.胆南星炮制及炮制前后成分变化研究
　　
　　依据《全国中药炮制规范（1988）》分别采用发酵法和混合蒸制法炮制胆南星，以原料（制）天南星与辅料猪胆汁1:4的投料量，得到6批发酵制胆南星和6批混合制胆南星。采用显微分析法观察比较了生天南星、制南星与胆南星中的毒针晶形态差异，考察毒针晶在炮制过程中的结构变化。结果显示，生天南星中针晶数量多且成簇，制南星、混合制胆南星中针晶数量大幅减少且多成散在，而发酵制胆南星中针晶束数量与长度也显着减少，表明天南星经胆汁发酵炮制胆南星过程中，针晶发生了变化。同时，运用紫外-可见分光光度法测定了生天南星、制南星与胆南星的酸提液与水提液中的草酸根离子含量，考察炮制前后草酸钙在炮制过程中的变化。结果显示生天南星的水提液草酸根离子浓度低于酸提液草酸根离子浓度，而胆南星的两种溶液中的草酸根离子浓度基本一致，由此显示发酵可使毒针晶中草酸钙结构破坏。论文首次系统比较了发酵制胆南星与天南星、混合制胆南星与制南星的小分子有机物的差异。运用LC-MS/MS结合Markerviewl.2.1软件，运用主成分分析（PCA）法，检索差异成分：
　　
　　（1）PCA统计发酵制胆南星与原料天南星、辅料猪胆汁样品LC-MS数据的结果显示，天南星胆汁发酵前后有170个显着性差异成分。其中发酵后天南星原有成分母离子丰度增加的有6个，降低的有46个。胆南星比天南星増加成分118个，其中来自猪胆汁的成分有28个，其余均为炮制所生成的新成分。胆南星中单糖、双糖和寡糖含量增加，但柠檬酸、硫酸化糖苷和碳苷类黄酮成分含量下降，脂肪酸衍生物含量降低。猪胆汁中结合型胆烷酸类成分经发酵后含量大幅降低。推测胆南星中新增加的成分，显示主要为氨基酸与还原糖类发生美拉德反应（Maillardreaction）形成了Amadori产物和亚胺-耻喃、亚胺-呋喃类成分，此外有乳酸和丁二酸及其糖苷、胆烷酸及其糖苷和硫酸化胆烷酸类等成分。根据成解析结果推测，天南星胆汁发酵炮制过程中肽键、糖苷键断裂，糖类与氨基酸、有机酸重新组合，生成新成分。
　　
　　（2）PCA统计混合制胆南星与原料制南星、辅料猪胆汁的LC-MS数据的结果显示，在分析阈值范围内，制南星中的成分含量降低，仅化合物C23H39N306含量增加；胆汁中的成分变化不明显，仅化合物C21H3606S显着含量降低。产生新化合物C1QH12N405,推测为羟基嘌呤核糖苷。采用硫酸-蒽酮法测定了生天南星、制南星与胆南星中总糖和多糖的含量，结果显示天南星发酵制胆南星多糖含量降低，且发酵制胆南星中多糖含量低于混合制胆南星。结LC-HRMS/MS分析结果，进一步说明发酵过程中糖苷键断裂。
　　
　　3.天南星与胆南星的药理作用比较
　　
　　采用戊四氮小鼠惊厥模型比较炮制前后物质抗惊厥作用的差异。小鼠分为空白组、阳性对照组、发酵制胆南星、混合蒸制胆南星、天南星和制南星组，根据药典规定临床人用量换算小鼠给药剂量为〇。6g/kg、1.2g/kg、2.4g/kg,阳性对照组投药地西泮（3mg/kg）。连续灌胃给药3天，于末次给药60min后腹腔注射戊四氮（100mg/kg）。参照Racine惊厥指标，观察30min内强直性阵挛发作情况，记录小鼠出现重度惊厥的时间及死亡时间。实验结果显示，天南星及其炮制品均有不同程度的抗惊厥作用C高剂量时p<0.05），可延长惊厥潜伏期，延长小鼠存活时间，提高存活率。胆南星作用有强于天南星的趋势。说以胆汁炮制可以增强天南星的抗惊厥效果。
　　
　　4.混合蒸制法胆南星质量标准的研宄
　　
　　按照现行版药典质量标准条款，分别测定了混合制胆南星样品的水分、灰分和浸出物；建立了分别鉴别两种制法胆南星中胆酸类成分的薄层色谱法。采用HPLC-ELSD法建立了同时测定游离型和结合型猪去氧胆酸和鹅去氧胆酸含量的方法，可以适用于两种制法生产的胆南星。方法学考察及样品测定结果显示，符合含量测定要求，方法重现性好，准确性高，可操作性强。实验中定量比较了两种炮制方法的自制胆南星中胆酸类成分的差异，混合制胆南星以结合型胆酸类成分GHDCA和GCDCA为主，平均含量分别为11.53%和5.62%;发酵制胆南星中以游离胆酸类成分HDCA和CDCA为主，含量分别为8.57%和6.21%.8批市售混合蒸制胆南星测定结果显示市售混合制胆南星中的结合型胆酸类成分含量远低于自制混合制胆南星，GHDCA和GCDCA仅含0.42%和0.27%;且市售胆南星中除结合型胆酸外同时存在游离型胆酸，HDCA和CDCA含量分别为0.1%?0.4%、0.1%?0.26%.表明市售样品中辅料胆汁投料与原料比显着低于1:4.暂定混合制胆南星甘氨猪去氧胆酸不得少于0.35%,甘氨鹅去氧胆酸不得少于0.3%,列入修订草案含量测定胆酸测定项下。参照现行版药典天南星与制南星饮片项下的含量测定方法，建立了基于紫外可见分光光度法的总黄酮含量测定方法；并采用HPLC法建立了夏佛托苷和异夏佛托苷含量测定方法。方法学考察符合含量测定要求。实验中测定了18批次胆南星样品，结果显示总黄酮含量最低0.053%、最高0.166%,相差较大，总黄酮平均含量0.091%,以夏佛托苷（C26H28014）计，不得少于0.07%,列入修订草案含量测定项下。本文通过HPLC-UV/ELSD、LC-MS/MS等技术，以天南星及胆汁成分分析为基础，系统比较了两种炮制法胆南星与其原料的成分差异，显示发酵制胆南星中成分相比于天南星和胆汁都有显着改变，涉及肽键、糖苷键断裂等；混合制胆南星中制南星成分降低，胆汁类成分变化不明显。采用戊四氮小鼠惊厥模型对天南星及胆南星药效作用进行对比，结果表明胆南星作用优于天南星，胆汁具有增强天南星抗惊厥作用的效果。论文同时对混合法制胆南星进行了初步的质量标准控制方法的研究，建立了薄层鉴别方法，采用HPLC-ELSD法建立了同时测定游离型和结合型猪去氧胆酸和鹅去氧胆酸含量的方法，以及建立了紫外分光光度法与HPLC法测定黄酮含量的方法，以期为胆南星质量标准的建立提供研宄基础。
　　
　　关键词：天南星；胆南星；中药炮制；HPLC;LC-MS/MS

目录

　　前言
　　
　　胆南星（Arisaemacumbile）是天南星（ArisaematisRhizoma）的一种传统炮制品，苦寒、微辛，凉，具有清热化痰，息风定惊之功效。临床上多见复方，用于痰热咳嗽，略痰黄稠，痰迷中风，癫狂惊痫等症。2015年版《中国药典》记载，胆南星炮制方法为“以制天南星的细粉与牛、羊或猪胆汁经加工而成，或为生天南星的细粉与牛、羊或猪胆汁经发酵加工而成。”表明胆南星的炮制方法有两种。首先，两种胆南星，一种采用发酵法，一种采用混合蒸制法；其次发酵法的原料为天南星生品细粉，而混合蒸制法使用的是制南星。因天南星炮制为制南星后毒性己经显着下降，而发酵法天南星毒性的下降与发酵过程相关，但机制不明。迄今，有关胆南星炮制的各方面研究较少。发酵法和混合蒸制法制备的两种胆南星，其效应是否有差异？两种炮制方法发生的物质转化是否有差异？胆汁作为辅料其炮制作用机制是什么？胆南星至今尚未见可控质量标准。因此，本论文将在查阅资料与调研市场的基础上，通过对原辅料的成分分析，研究天南星经胆汁发酵炮制及混合法制胆南星前后成分及药效变化，同时以混合法制胆南星为研究对象，进行质量标准控制方法的研究，以期为胆南星的炮制机制、质量控制等提供研宄依据。

　　第一章文献研究
　　
　　摘要 本章就胆南星的炮制历史沿革、现代炮制工艺，天南星、胆汁及胆南星成分研宄，胆南星药理作用等方面，进行了较为系统的综述，为论文开展提供依据。关键词胆南星，天南星，胆汁天南星ArisaematisRhizoma为天南星植物天南星JnSaema（Wall.）Schot、异叶天南星BL.或东北天南星JrhaewaMaxim.的干燥块茎。天南星在我国拥有两千多年的用药历史，其味苦、气味辛，性温，有毒，临床用于顽痰咳嗽、风痰眩晕、中风、口眼涡斜、半身不遂、癫痫、惊风、破伤风等疾病的治疗，有祛风定惊、燥湿化痰、消肿散结的功能[1].天南星炮制品历代以来有姜制、姜甘草制、姜矾制，胆汁制等[2],其中胆南星为2015版中国药典项下天南星的炮制品之一。胆南星味苦、微辛，归肺肝、脾经。清热化痰，息风定惊。常用于痰热咳嗽，咯痰黄稠，中风痰迷，癫狂惊痫。其制法有两种，一是采用制天南星细粉与牛、羊或猪胆汁经混合加工而成；二是采用生天南星细粉与牛、羊或猪胆汁经发酵加工而成[3].目前，天南星诸多炮制品中制天南星的研究较多，有关胆南星的研究较少。本文将对胆南星现有研究进展进行综述。
　　
　　1.1胆南星炮制工艺发展
　　
　　1.1.1历史沿革
　　
　　牛胆汁制南星的最早记录见于宋代《小儿药证直诀》“腊月酿牛胆中阴干百日”[4].运用羊胆汁制的方法则首次出现于《普济本事方》[5].宋代《圣济总录》中有记载“牛胆中煮一伏时暴干”[6],与《太平惠民和剂局方》中记录的牛胆汁制饼法“汤洗，焙，为末，用牛胆汁和作饼，焙干”[7]都可看作现代制天南星与胆汁混合加工炮制胆南星的雏形。元代、明代沿用了牛胆汁制饼法和牛胆汁制法，且对工艺和品质等做出了更详细的评价，认为胆南星炮制时间久、且胆汁用量多者品质更好。
　　
　　如《本草纲目》中有造胆星法：“以南星生研末，腊月取黄枯牛胆汁，和剂纳入胆中，系悬风处干之，年久者弥佳。”[8]《丹溪心法》中提到：“须用黄牯牛胆，腊月粉南星亲手修和，风干，隔一年用。牛胆须入三、四次者佳。”[9]
　　
　　明代也发展了用姜汁、明矾与天南星共制后制胆南星的方法，如《炮炙大法》天南星项下记载：“滚汤明矾或姜汁和泡用，用泡过者为末，入腊月黑牛胆中阴干用。”[1°]清代《幼幼集成》新增加有九制牛胆星[2],此外还有酒蒸法[2].
　　
　　1.1.2现代炮制工艺
　　
　　现行的胆南星炮制方法主要分发酵法和混合蒸制法[3]发酵法采用生天南星细粉与胆汁发酵加工而成，混合蒸制法采用制南星细粉与胆汁拌匀，蒸制而成，个别地区如广西浙江、上海采用制南星与胆汁发酵制胆南星。表1-1中可见全国各地炮制规范中胆南星的炮制工艺，可以看出各地辅料的品种、用量、及生产周期都有所差异。各地大多都收录有2两种炮制方法，两法差异较大。发酵法由于传统工艺认为“历时久佳”,普遍耗时较长，数天至一年不等。混合法生产周期短，只需20min至数小时。各地辅料运用不一，江西、福建与北京除了加入辅料胆汁，还分别加入川贝末、大黄、黄酒与芝麻油共制。以100kg天南星计，辅料胆汁用量少至64kg,多至700kg,其中最多见的是每100kg（制）天南星用胆汁400kg.
　　
　　由于胆南星传统炮制工艺耗时长，有学者曾对工艺改进进行研宄。曲虹[12]采用定温干燥法，分次将胆汁加入生南星粗末于50°C干燥，经36?45d可完成。江林[13]先将胆汁浓缩，再与制南星粉混合，加入芝麻油揉均匀，80°C~90°C干燥，制南星与胆汁用量比1:6,此方法可将时间缩短为6天。随后高万山[14]比较新旧工艺，得出结论新蒸制法可以缩短时间，改善质地、气味，提高胆酸含量，避免杂菌污染。唐思园[15]
　　
　　研究了发酵制胆南星的工艺，考察了发酵原料、温度和湿度等影响因素，以胆酸含量为指标，最后确定以牛胆粉为原料，在37°C下干燥发酵可以使胆酸和去氧胆酸的含量最高。
　　
　　1.2胆南星成分研究
　　
　　1.2.1天南星研究
　　
　　天南星化学成分复杂，己有研宄显示其中包含黄酮类、氨基酸类、脂肪酸和留醇类、苷类、生物碱类、凝集素类等1.2.1.1黄酮类成分杜树山等[16]从天南星根茎乙醇提取物中分离纯化得到6种黄酮类化合物，鉴定为芹菜素-6_C_[3_D_吡喃葡萄糖_8_C_a-L-阿拉伯糖苷（夏佛托苷）、芹菜素-6-C-a-L-阿拉伯糖_8_C-P_D_吡喃葡萄糖苷（异夏佛托苷）、芹菜素6-C-阿拉伯糖-8-C-半乳糖苷、芹菜素-6-C-半乳糖-8-C-阿拉伯糖苷、芹菜素-6,8-二-C-葡萄糖苷、芹菜素-6,8-二-C-半乳糖苷。苏振丽[17]从东北天南星干燥块茎中也鉴定出夏佛托苷和异夏佛托苷。居羚[18]应用液质联用技术，通过图谱解析显示天南星中有15~18个黄酮碳苷成分，推测这一系列黄酮类成分为苷元以芹菜素和木犀草素为主的同分异构体。
　　
　　1.2.1.2氨基酸和有机酸类成分
　　
　　季申[19]对10种药用天南星进行分析，结果显示均含有39种氨基酸及肽类化合物GC-MS及LC-MS分析显示天南星中含有柠檬酸、苹果酸、壬二酸、癸二酸、油酸、棕榈酸等多种有机酸t%.王星等采用UHPLC-MS/MS解析了天南星中18个氨基酸和2个胺类化合物，并建立了天南星中15种氨基酸类定性与定量分析方法，采用柱前衍生化技术，以异硫氰酸苯酯（PITC）为衍生化试剂，可快速鉴定和测定中药中氨基类成分。
　　
　　1.2.1.3脂肪酸及甾醇类成分
　　
　　李绪文[21]等采用气质联用技术对东北天南星根脂肪酸进行了定性定量分析，鉴定了16个脂肪酸。汪晓莉等[22]也对天南星中脂肪酸类成分进行研究，鉴定了27种脂肪酸，主要为以软脂酸和油酸为主的饱和脂肪酸，占脂肪酸总量66.45%;不饱和脂肪酸占比33.55%,其中主要为亚油酸。李和伟[23]等从天南星中分离得到棕榈酸，（3-谷甾醇，单棕榈酸甘油酯，胡萝卜苷及二十五烷酸和二十六烷酸的混合物。杜树山等[24]从天南星乙醇提取物的石油醚部分得到三十烷酸、P-谷留醇、没食子酸乙酯、四十烷烃、胡萝卜苷、没食子酸、二十六烷酸。
　　
　　1.2.1.4生物碱类与核苷类
　　
　　迄今报道从天南星科的植物中发现的生物碱主要包括：吡咯和四氢吡咯类、哌啶和吡陡类、环二肽类、卩比嗪类、n引噪和口一昨啉类、Homonojirimycin类以及其他类型[25].SylvieDucki等[26]从天南星的块茎中鉴定一生物碱为aurantiamideacetate.也有报道称天南星含有葫芦巴碱p7].黄鲛等_建立了HPLC测定天南星8种核苷的含量测定方法，包括尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷、胸苷、腺苷。1.2.1.5挥发性成分杨乃嘉等[29]利用水蒸气蒸馏法提取天南星中挥发油并运用GC-MS进行测定，首次检索鉴定出52个化学成分，其中相对百分含量大于2%的为间位甲酚，芫妥醇，2,2'-次甲基呋喃，2-糠基-5-甲基呋喃，苯乙稀，2-稀丙基呋喃，2-呋喃甲醇乙酸酯。1.2.1.6苷类成分邹晓红等[3（）]和李绪文[31]等分别从东北南星和异叶南星中分离到胡萝卜苷。JeeHJ[32]W东北天南星分离到一系列二酰基丙三醇半乳糖苷。东北南星中分离到具有保肝活性的五个脑苷脂类化合物。1.2.2胆汁主要成分研究在我国，胆汁的使用历史悠久，明代李时珍的本草纲目中收录了31种动物胆，2000年起，猪胆粉收录于《中国药典》。胆汁性寒味苦，具有清热解毒，利湿，止咳，通便等的功效[1].胆汁除了直接入药，也常用作辅料，与药物共制后可降低药物的毒性、热性燥性，改变药性，增强药物镇惊、化痰、除烦等[34].如天南星经胆汁炮制后可降低其毒性，功效由燥湿化痰变为清热化痰；黄连经胆汁炮制后，可以使其苦寒之性增强。常用的胆汁辅料来源为猪科动物猪Briss.、牛科动物牛Gmel.、羊Copra/u'rcwsL.或维科动物鸡t/omeyf/cwsBriss.等的胆汁。近代分析研宂发现，胆汁中极大部分是水分，主要成分有胆汁酸、胆色素、卵磷脂、胆固醇、氨基酸及少量蛋白、少量脂肪、胆碱以及氯化钠、磷酸钙等无机盐[35].
　　
　　1.2.2.1胆酸类成分
　　
　　张启明[35]对牛胆粉的多种成分进行了含量测定，结果显示牛胆粉中，主要含牛磺胆酸（TCA）、牛磺去氧胆酸（TDCA）、甘氨胆酸（GCA）、甘氨去氧胆酸（GDCA）等结合胆汁酸，且TCA和GCA含量基本相仿，总的牛磺结合型和甘氨结合型胆汁酸的比例也基本接近。猪胆汁主要含有鹅去氧胆酸（CDCA）、猪去氧胆酸（HDCA）、猪胆酸（HCA）、3ot-羟基-6-氧-5a-胆烷酸和石胆酸与甘氨酸形成的结合型胆酸，其中猪去氧胆酸、猪胆酸是猪胆汁特有的成分[36].胆汁中游离型胆汁酸的含量通常很低，如果测得游离胆汁酸含量偏高，可表明胆汁不新鲜或加工贮存不当，己在细菌的作用下酵解或分解，从而降低了结合胆汁酸的含量，总胆汁酸含量也会有显着下降[35].早期的胆汁含量测定方法采用薄层扫描法[37]、1^1^王1^0[38]等，利用高温及碱性环境将胆汁中结合型胆汁酸水解为游离型进行检测分析。但经水解后成分不专属，不适合作为评价胆汁质量的标准。石岩[39]等针对牛胆粉药材中的主要活性组分胆汁酸类，运用HPLC-ELSD建立牛胆粉指纹图谱及多组分含量测定方法，显示自制样品与市售样品差异较大，为完善该药材质量控制提供科学依据。谭春梅[4°]等运用HPLC-UV法同时测定猪胆粉中牛磺猪去氧胆酸和甘氨猪去氧胆酸的含量，可用于猪胆粉的质量控制。郑兴[411以熊去氧胆酸（UDCA）、牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）、鹅去氧胆酸（CDCA）三种胆酸为研宄对象，分别以吡啶-苯甲酰氯和溴乙酰基对硝基苯为衍生化试剂，建立了胆酸的柱前衍生化HPLC-UV法，提高了胆酸类成分的灵敏度和线性范围。斯日古楞等[42]采用固相萃取等前处理方法，富集胆汁酸类化合物进行UFLC分析，在猪胆汁中检测到5种结合型胆汁酸和1种游离型胆酸，含量较高的是GCA和GDCA.
　　
　　1.2.2.2胆色素
　　
　　胆汁中含有胆红素。胆红素的含量测定方法主要有重氮化试剂比色法[43],紫外分光光度法[44],薄层扫描法[45],和高效液相色谱法[46]等。李先端等[46]针对目前猪胆汁缺乏实际的质量标准的情况，采用HPLC对猪胆汁中胆红素进行测定，各批次含量在18?50%不一
　　
　　1.2.2.3胆固醇
　　
　　牛胆粉中的胆固醇有游离和酯结合二种形式存在，中国药品生物制品检定所的张启明等[35]采用气相色谱法对其含量进行测定。测定结果表明，在牛胆汁中，胆固醇以酯结合型为主，且总胆固醇含量不高，只有0.11%-0.38%.
　　
　　1.2.2.4氨基酸类成分
　　
　　胆汁中的氨基酸的存在形式也以与胆汁酸形成的结合型胆汁酸为主，游离氨基酸的含量很低[35].牛胆汁的总氨基酸含量中甘氨酸和牛磺酸含量较高，主要来源于甘氨酸和牛磺酸的结合型胆汁酸。胆汁中实际以蛋白、肽类形式存在的量并不多。
　　
　　1.2.2.5无机元素

　　张启明[35]采用电感耦合氩等离子体直读光谱仪测定法测定牛胆粉中的无机元素，表明牛胆粉中还含有多种无机元素，约占3.85%?4.64%,且主要是以胆汁酸盐形式存在的Na、K及Ca、Mg、P等。张晓薇等[47]通过火焰原子吸收法对8种胆汁中的10种金属元素进行了含量测定，结果显示不同属动物胆汁中含有的金属元素差异很大：牛胆汁中锌、铁、钾的含量最高，分别为49.8mg/L、17.1mg/L、767.9mg/L;而猪胆含锌、铁都最少，含锰最多，为2.75mg/L;而羊胆中的微量金属兀素含量略低。
　　
　　1.2.3胆南星成分研究
　　
　　目前，对于胆南星中成分的研究主要集中在辅料胆汁中的胆酸类成分。分析手段包括薄层色谱、紫外分光光度计、HPLC-UV/ELSD/CAD（高效液相色谱-电雾式检测器法）等。万军[48]等采用紫外分光光度计，以鹅去氧胆酸为对照品，加入50%硫酸溶液75°C加热显色，于377nm波长处测定，建立了胆南星中总胆酸含量测定的方法。王光函等[49]建立HPLC-ELSD法测定胆南星中胆酸含量的方法，以乙腈-0.2%醋酸为流动相，胆酸为对照品。赫炎等用HPLC-ELSD法测定猪去氧胆酸含量，流动相甲醇-水-冰醋酸（75:25:0.01）。陈江宁等[51]采用HPLC-CAD法检测猪、牛、羊胆汁与天南星生品发酵制备胆南星中胆酸、去氧胆酸、猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸的含量，不同胆汁原料的胆南星中胆酸类成分存在差异。赵启苗%等采用紫外分光光度法和HPLC-CAD分别建立胆南星中总胆酸，猪去氧胆酸和鹅去氧胆酸的含量测定方法。由于药典胆南星项下只收录了性状、显微鉴别和鉴别胆酸的硫酸-糠醛反应，许多学者对胆南星质量标准进行研究。姚志昂[53]等抽取了药材市场、医院、零售药店等单位的31批胆南星样品进行质量检测，发现药典方法仅能鉴别天南星部分，进而新增了薄层色谱鉴别胆汁和灰分分析，有助于与药典方法结合更好的控制胆南星质量。张绍轩[54]等选择牛、羊、猪胆汁共有的鹅去氧胆酸为对照，建立了胆南星的薄层色谱鉴别方法。贲永光[55]等以猪去氧胆酸为对照品，建立了针对猪胆汁制胆南星的薄层色谱鉴别方法。朱燕飞[56]等运混合炮制工艺实验研制饮片、TLC分析、主成分分析、多元方差分析的方法探讨胆南星加工过程中，不同工艺参数对饮片TLC图谱的定量影响，以及相同工艺条件不同批次样品图谱的分布，发现猪胆汁来源对TLC图谱中各个峰高值的联合分布有非常显着影响。李欣逸[57]采用电子鼻技术建立气味指纹图谱，可实现对不同发酵时间和不同胆汁比例的胆南星样品进行区分，为胆南星的定性鉴别提供思路与参考。蔡宇忆[58]对胆南星的质量标准进行了详细研究，建立了胆南星中胆酸类成分的薄层色谱鉴别方法，以环己烷-乙酸乙酯-冰醋酸（11:3:2）为展开剂，10%硫酸乙醇溶液为显色剂，105°C加热，显示分离效果好。并分别采用紫外分光光度法和高效液相色谱法建立了总黄酮、总多糖、核苷类和胆酸类的含量测定方法，测定了样品中总黄酮、总多糖、核苷类和胆酸类化学成分的含量。提出运用灰色关联度分析模型评价胆南星的质量。

　　1.3胆南星药理作用

　　天南星经胆汁炮制后，除去燥烈之性和毒性，功能由燥湿化痰转为清热化痰，消肿散结转化为息风定惊[2].
　　
　　倪朱谟着《本草汇言》：“前人以牛胆制之，名曰胆星。牛胆苦寒而润，有益肝镇惊之功，制星之燥而使不毒。若风痰、湿痰，急闭涎痰，非南星不能散；如小儿惊风、惊痰、四肢搐搦，大人气虚内热、热郁生痰，非胆星不能疗也。二者施用，随证投之。”[68]胆南星常用于痰热咳嗽，咳痰黄稠，中风痰迷，癫狂惊痫等症[1].在临床上多配伍使用，很少见有单味药应用。如中医经典方神仙解语丹、清气化痰丸、小儿回春丹、定痫丸、涤痰汤、抱龙丸等中均配有胆南星。与天竹黄、郁金、黄连、石菖蒲、远志等合用，可用于热型中风昏仆及癫痫病；与瓜蒌、黄芩、桔梗、牛蒡子等配伍，可治疗热痰壅肺，咯痰黄稠[59].
　　
　　1.3.1中枢抑制作用
　　
　　赫炎[6（）]对发酵法和混合蒸制法炮制胆南星的毒性和中枢抑制作用进行了比较，两种炮制品均未见毒性，水浸液和乙醇提物腹腔注射都有促进戊巴比妥钠催眠的作用，其中混合法的醇提物优于发酵法的醇提物。杨伟鹏等[61]
　　
　　研究不同胆汁炮制天南星是否有减毒存效的作用，考察了小鼠急性毒性实验、对小鼠自主活动影响、睡眠时间影响、及戊四氮惊厥模型实验，表明猪、牛胆汁均能使天南星解毒存效。张横柳[62]
　　
　　研究益气熄风化痰药抗癫痫的机制，采用青霉素诱导的大鼠慢性癫痫模型，观察癫痫大鼠脑皮层电图，测定脑内7-氨基丁酸（GABA）、谷氨酸（Glu）含量变化，其中化痰药胆南星具有抗痫样放电作用，且对Glu下调作用最强。
　　
　　1.3.2清热作用
　　
　　陈江宁等[51]比较不同胆汁发酵制胆南星的解热作用差异，结果显示胆南星均有一定的清热效果，且牛、猪胆汁的效果优于羊胆汁。王薇等[63]考察天南星和胆南星的寒热药性，通过多种量化指标包括体温、耗氧量、肝组织ATP酶、总蛋白、脏器系数等、饮水量、食量等，说明寒热药性与之相关，且符合炮制后药性由温转凉的传统理论。
　　
　　1.3.3抗炎抗氧化活性
　　
　　Chang-Bum_[64]考察胆南星抗氧化活性，发现其水提液能有效清除DPPH（1,1-二苯-2-三硝基苯肼）、过氧化氢、羟基自由基，具有强还原能力。
　　
　　通过细胞毒性测试发现，其对纤维细胞没有显着毒性，并且能抑制细胞内活性氧（ROS），上调谷胱甘肽水平，呈剂量依赖型。另一实验中[65]评估了胆南星提取物的抗炎活性，发现能明显抑制促炎性细胞因子包括白细胞介素（IL）-1（3,IL-6,肿瘤坏死因子（TNF）-a的产生，并抑制这些细胞因子的mRNA和蛋白的表达。此外，胆南星提取物还可抑制LPS诱导的诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和环氧化酶-2（C0X-2）蛋白和基因在PMA分化的THP-1巨噬细胞的表达。
　　
　　1.4胆南星毒性研究
　　
　　天南星的毒性历代都有记载，如今在《中国药典》中被列为有毒品种之一。其毒性主要表现在对口腔、咽喉及粘膜有很强的刺激性。课题组前期研究表明[&67],天南星科植物的毒性成分是具有特殊结构的“毒针晶”,草酸钙针晶和针晶所附的凝集素蛋白共同作用而造成刺激性毒性。《本草汇言》中有记载“天南星。
　　
　　其性味辛燥而烈，与半夏略同，而毒则过之”、“牛胆苦寒而润，有益肝镇惊之功，制星之燥而使不毒”[6S].由此可见，天南星经胆汁炮制后，毒性下降。胆南星未见有毒性报道。赫炎等[6°]
　　
　　对发酵制和混合蒸制胆南星进行毒性实验，试验剂量范围内的混悬液灌胃及醇提物腹腔注射给药都未见毒副和刺激反应。杨中林等[69]以兔眼刺激性实验比较了不同炮制品的刺激性，显示胆汁制品毒性低于天南星生品和姜矾制品。8
　　
　　1.5小结
　　
　　通过文献研宄发现，迄今有关胆南星的研究较为局限。质量控制标准尚不完善，主要集中于胆汁类成分的研宄，而对天南星类成分的鉴别和含量测定都研宄较少；未标示两种不同炮制方法胆南星的质控差异。且对于胆南星的药理作用有部分探索，但其相对应的效应物质基础不明。发酵法和混合蒸制法两种炮制工艺差异明显：混合蒸制法的减毒效果源于原料制天南星炮制过程中明矾的参与，而发酵法能使天南星毒性降低的原因不明；发酵过程涉及微生物、酶等的参与，是否会造成较大的成分转化，且与混合法生产过程中的成分变化形成较大差异。因此，发酵制胆南星和混合制胆南星是否可以临床混用以及共用质量标准值得进一步研究。辅料胆汁加入比例各地也不尽相同，能否把总胆酸含量作为控制胆南星质量的指标，总胆酸含量达到多少才能证明为合格的胆南星，总胆酸含量的高低对药效有无影响，都有待深入探讨。

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　　第三章胆南星炮制前后成分变化研宄
　　第一节胆南星制备
　　第二节炮制前后毒针晶变化研究
　　第三节基于LC-HRMS/MS的胆南星炮制前后成分变化研究
　　第四节天南星、制南星与胆南星总糖和多糖含量差异研究
　　小结

　　第四章胆南星炮制前后药理作用比较

　　第五章混合蒸制胆南星质量标准研宄
　　第一节胆南星鉴别方法研究
　　第二节检查项测定
　　第三节基于HPLC-ELSD法的胆汁酸含量测定方法研
　　第四节基于紫外-可见分光光度法的总黄酮含量测定方法研
　　第五节基于HPLC法的黄酮含量测定方法研究
　　小结

　　混合制胆南星质量标准（修订草案）

结语

　　
　　本论文在查阅资料与调研市场的基础上，研究了天南星经胆汁发酵炮制及混合法制胆南星前后成分及药效变化，同时对混合法制胆南星初步进行了质量标准控制方法的研究，主要研究内容总结如下：
　　
　　（一）主要研究结果
　　
　　1.对胆南星的原料生天南星及胆汁进行了成分组成和质量控制研究采用HPLC法，建立了猪、牛和羊胆汁的指纹图谱。结果显示猪胆汁与牛、羊胆汁中胆汁酸类成分有显着差异。三者HPLC指纹图谱可用于鉴别猪、牛、羊胆汁，控制胆汁质量。采用液相色谱串联高分辨二级质谱（LC-HRMS/MS）
　　
　　（1）系统解析了天南星中主要的小分子有机物，发现其中保留时间〇。95-1.25min主要为小分子有机酸、硫酸化糖苷与磺基化糖苷；2-6min为含氮化合物，主要为核苷类成分；ll-20min主要为黄酮碳苷类成分；21-41min为长链脂肪酸及其衍生物，并对其中81个成分进行了类别归属。
　　
　　（2）系统比较了猪、牛和羊胆汁的胆汁酸类成分。结果显示，三种胆汁中胆汁酸类成分主要为牛磺酸和甘氨酸结合型胆汁酸；其母核主要为胆酸、脱氢胆酸、去氧胆酸和去氧脱氢胆酸；猪胆汁的胆汁酸类成分以猪胆酸系列为主，牛、羊胆汁的胆汁酸类成分以胆酸系列为主，并且猪胆汁比牛羊胆汁有更多的脱氢胆酸同分异构体，两者均含有鹅去氧胆酸系列胆汁酸。
　　
　　研究结果表明，牛、羊胆汁中的胆汁酸类成分较为相近，而猪胆汁与牛、羊胆汁中的胆汁酸类成分存在显着差异。
　　
　　2.胆南星炮制及炮制前后成分变化研宄本文采用显微分析法观察结合紫外-可见分光光度法比较并考察毒针晶在炮制过程中的结构变化。结果表明天南星胆汁发酵炮制胆南星过程中，针晶中草酸钙结构被破坏。采用LC-HRMS/MS技术，结合Markerviewl.2.1软件，运用主成分分析（PCA）法，检索差异成分。结果显示
　　
　　（1）天南星胆汁发酵前后有170个显着性差异成分。其中发酵后天南星原有成分母离子丰度增加的有6个，降低的有46个。胆南星比天南星增加成分118个，其中来自猪胆汁的成分有28个，其余均为炮制所生成的新成分。胆南星中单糖、双糖和寡糖含量增加，但柠檬酸、硫酸化糖苷和碳苷类黄酮成分含量下降，脂肪酸衍生物含量降低。猪胆汁中结合型胆烷酸类成分经发酵后含量大幅降低。新增加的成分主要为氨基酸与还原糖类发生美拉德反应（Maillardreaction）形成了Amadori产物和亚胺-卩比喃、亚胺-呋喃类等成分。根据成分解析结果推测，天南星胆汁发酵炮制过程中肽键、糖苷键断裂，糖类与氨基酸、有机酸重新组合。
　　
　　（2）混合制法胆南星中制南星的成分含量降低，仅化合物C23H39N306含量增加，但未能归属；胆汁中的成分变化不明显，仅化合物C21H3606S显着含量降低。产生新化合物C1QHI2N405,推测为羟基嘌呤核糖苷，但来源及机理尚不清楚。由此可见，发酵制胆南星与混合制胆南星差异显着：发酵制胆南星中新生成糖胺及亚胺类成分等；相较于混合制胆南星，发酵制胆南星中黄酮糖苷类成分明显减少；混合蒸制胆南星中胆酸类主要保留了结合型，而发酵制胆南星中结合型胆酸经分解主要以游离型存在。米用硫酸-恩丽法测定j生天南星、制南星与胆南星中总糖和多糖的含量，结果显不天南星发酵制胆南星多糖含量降低，且发酵制胆南星中多糖含量低于混合制胆南星。结合LC-HRMS/MS分析结果，进一步说明发酵过程中糖苷键断裂。
　　
　　3.天南星与胆南星的药理作用比较采用戊四氮小鼠惊厥模型比较炮制前后物质抗惊厥作用的差异。实验结果显示，天南星及其炮制品均有不同程度的抗惊厥作用（高剂量时P<〇。〇5），可延长惊厥潜伏期，延长小鼠存活时间，提高存活率。说明以胆汁炮制可以增强天南星的抗惊厥效果。
　　
　　4.混合蒸制法胆南星质量标准的研究按照现行版药典质量标准条款，分别测定了混合制胆南星样品的水分、灰分和浸出物；建立了分别鉴别两种制法胆南星中胆酸类成分的薄层色谱法，特征性、专属性强采用HPLC-ELSD法建立了同时测定游离型和结合型猪去氧胆酸和鹅去氧胆酸含量的方法。可以适用于两种制法生产的胆南星，方法学考察及样品测定结果显示，符合含量测定要求，方法重现性好，准确性高，可操作性强。自制胆南星含量测定结果显示混合制胆南星中主要为GHDCA和GCDCA,发酵制胆南星中主要为HDCA和CDCA.同时测定了8批市售混合蒸制胆南星，结果显示市售混合制胆南星中的结合型胆酸类成分含量远低于自制混合制胆南星，且市售胆南星中除结合型胆酸外同时存在游离型胆酸。暂定混合制胆南星甘氨猪去氧胆酸不得少于0.35%,甘氨鹅去氧胆酸不得少于0.3%,列入修订草案含量测定胆酸测定项下。参照现行版药典天南星与制南星饮片项下的含量测定方法，建立了基于紫外可见分光光度法，以试样为空白的总黄酮含量测定方法；并采用HPLC法建立了夏佛托苷和异夏佛托苷含量测定方法。方法学考察符合含量测定要求，具有可操作性。以夏佛托苷（c26h28o14）计，不得少于0.07%,列入修订草案含量测定项下。
　　
　　（二）论文主要创新点
　　
　　1.建立了猪牛羊胆汁的HPLC指纹图谱，可有效鉴别猪牛羊胆汁。
　　
　　2.基于HPLC-ELSD建立了同时测定两种制法胆南星中的胆酸类成分；基于紫外-可见分光光度法建立了以试样为空白的总黄酮含量测定方法，并建立了胆南星中夏佛托苷和异夏佛托苷含量的HPLC测定法。
　　
　　3.基于LC-HRMS/MS技术结合PCA法研宄了发酵制胆南星与生天南星、混合制胆南星与制南星的成分差异。

　　研究成果
　　致谢

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