大蒜（Allium sativum）是天门冬目（Asparagales）葱科（Alliaceae）葱属（Allium）植物，又名胡蒜、葫，它既可以做调味品也有药用价值。中医理论认为大蒜味辛、性温，入脾、胃、肺经，具有温中消食、行滞气、暖脾胃、消积、解毒、杀虫的功效，主治饮食积滞、脘腹冷痛、水肿胀满、泄泻、痢疾、疟疾、百日咳、痈疽肿毒、白秃癣疮、蛇虫咬伤以及钩虫、蛲虫等病症，近年大量实验研究和临床验证证实了大蒜具有抗血小板凝聚、降血压、改善血流纤溶活性和外周微循环、显着降低血液黏稠度和改善红细胞浓集现象、抗实验性动脉粥样硬化、扩张血管和防治脑梗塞等作用，对中老年人的这一常见病和多发病有肯定和综合的防治作用。

　　大蒜的活性成分有蒜氨酸（alliin）、蒜酶（allinase）、大蒜辣素（allicin）和阿霍烯（cis-ajoene,trans-ajoene）等。目前对大蒜的药理作用、生物活性和临床开发利用的研究较多[1-5].在植物性食品的鉴定中，一般是利用形态学、细胞学、生理学等方面的特征进行表型分析和资源的分类。随着分子生物技术的发展，利用数据信息量较大的DNA分子信息，直接从DNA分子水平进行物种鉴定已成为一种快速有效的方法[6].

　　目前，rRNA基因序列分析技术已应用于食品的检测和鉴定中，扩增植物rRNA基因并进行碱基序列测序分析，是进行分子鉴定的很好标记。

　　相关研究表明，rRNA基因用于食品质量监控、鉴定是高效可行的方法[7-14].李萍等[15]研究了忍冬科植物忍冬的5SrRNA基因间序列的变异，探讨了金银花药材道地性的基因基础。有研究者根据模式植物拟南芥的18SrRNA基因序列设计引物，对三七根的18SrRNA基因序列进行基因克隆、测序，并与模式植物拟南芥以及人参属植物喜马拉雅人参的相应序列进行比较。通过对产于广西靖西的三七根的18SrRNA基因进行克隆测序，获得了三七根的18SrRNA基因的部分序列特征[8].

　　也有人分析了三七及其伪品竹节参蓬莪术、温莪术、桂莪术的18SrRNA基因序列，确定蓬莪术、温莪术和桂莪术18SrRNA基因序列之间只有1个变异位点，而与三七之间有94个[9].本文对大蒜核糖体18SrRNA和叶绿体16SrRNA基因序列进行扩增和序列分析，与GenBank数据库中相近序列进行了比对，分析了大蒜的分类问题，为相关食品分类和鉴定提供了方法参考。

　　1材料与方法。

　　1.1材料和试剂。

　　大蒜样品采自于徐州市铜山区菜地，采摘后立即带到实验室进行研究分析。实验所用的生化试剂使用“国药集团化学试剂有限公司”产品，基因组提取、DNA胶回收等试剂盒和分子生物学试剂购自 “天根生化科技（北京）有限公司”.

　　1.2基因组和叶绿体。

　　DNA的提取将新鲜大蒜除去表皮，进行表面除菌后，使用液氮在无菌研钵中研成粉末，使用基因组提取试剂盒提取大蒜基因组DNA.叶绿体DNA参照文献[15]的方法提取。将大蒜绿叶进行组织匀浆，差速离心分离，密度梯度离心，分离提取叶绿体，使用苯酚/氯仿抽提大蒜叶绿体DNA.使用完整性好的DNA作为PCR模板，-20℃保存。

　　1.3 rRNA基因序列扩增。

　　使用LA-Taq DNA聚合酶扩增大蒜核糖体的18SrRNA和叶绿体的16SrRNA基因片断。PCR反应条件：94℃预变性3min,94℃变性60s,56℃退火60s,72℃延伸90s,反应25个循环，72℃延伸10min.核糖体18SrRNA基因的引物是[10-12]:F 5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′和R 5′-TCCGCAGGT-TCACCTACGGA-3′。叶 绿 体16SrRNA基 因 的 引 物 是：F5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，R5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。

　　1.4克隆测序。

　　将目的片段进行胶回收，与载体连接，用于测序。连接体系是1μLT4DNA连接酶缓冲液、1μL pGEM-T载体、1μL T4DNA连接酶、3μL回收的DNA片段，用灭菌ddH2O补充体积至10μL.16℃连接4h,转化DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，送生物公司测序[16]。

　　1.5序列分析。

　　使用DNAMAN软件将GenBank中与大蒜序列相近物种的18SrRNA和叶绿体16SrRNA基因序列进行比对，分析大蒜的分类地位[17].

　　2结果与讨论。

　　2.1大蒜。

　　rRNA基因扩增使用PCR方法获得了大蒜的核糖体18SrRNA和叶绿体16SrRNA基因片段如图1所示。在琼脂糖凝胶电泳中检测序列，无杂带。将片段克隆测序，获得两条片段的序列。将序列登录到NCBI,两基因序列的登录号分别是：18SrRNA（JF719285），16SrRNA（JF719286）。

　　2.2序列分类。

　　使用NCBI的BLAST程序获得GenBank数据库中18SrRNA基因与大蒜相近的序列，确定相关物种的类别，分析大蒜与相关物种的分类关系（图2）。分析结果显示，葱属的大蒜、球序韭（Allium thunbergii）、韭菜（Allium tuberosum）、茖葱（Allium victorialis）相似性都很高，它们在分析结果的下面一个大分支中。其中，大蒜与球序韭的序列相似性最高，说明两者演化关系较近。

　　在分析结果的上面一大分支中大多是龙舌兰科（Agavaceae）、天门冬科（Asparagaceae）的物种。分析GenBank数据库中叶绿体16SrRNA基因与大蒜相近的序列（图3）。分析结果显示，在系统发育树的最下面葱科的大蒜、龙舌兰科的Yucca filamentosa和薯蓣科（Dioscoreaceae）的Dioscoreasp.3个物种聚类成一个分支。说明三者的演化关系较近。

　　3结论。

　　本文研究显示，rRNA基因序列分析在植物分类鉴定中具有较好的应用价值。本文利用基因组中核糖体RNA基因探讨大蒜的分子分类，发现大蒜与葱科植物在18SrRNA序列上具有较高的同源性，这与基于形态学进行的传统分类研究是一致的。

　　而16SrRNA基因显示，大蒜与龙舌兰科和薯蓣科3个物种聚类成一个分支，说明18SrRNA序列在植物演化方面的区分度比16SrRNA高。（图略）

　　参考文献：

　　[1]常军民，李燕菊，于鲁海，等。大蒜药材HPLC特征图谱研究[J].药物分析杂志，2009,29（2）：205-208.

　　[2]吴晓莉，许健，张婷，等。大蒜蒜氨酸酶基因克隆与序列分析及毕赤酵母表达质粒的构建[J].吉林农业大学学报，2010,32（3）：258-263,283.

　　[3]黄雪松，温丽儿，宴日安。利用4-MP测定大蒜中的蒜氨酸[J].食品科学，2006,27（1）：171-174.

　　[4]潘金丽。大蒜素胶囊合半夏泻心汤治疗H IV/A IDS相关性慢性腹泻10例[J].中医研究，2010,23（5）：55-56.

　　[5]卓鹰，石娜，黄 泳，等。大 蒜 膏 外 贴 神 阙 穴 对 睡 眠 剥 夺 疲 劳 者 尿 液 淀 粉 酶 变 化 的 影 响 [J].时 珍 国 医 国 药，2009,20（12）：2974.

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