小麦是世界上最重要的粮食作物之一，小麦籽粒制品不仅供给人们热量，而且也是人们重要的植物蛋白质来源。然而，小麦籽粒蛋白质中几乎都存在着一些必需氨基酸缺乏的问题，尤其是赖氨酸含量最低，平均仅在3%左右［1］，远低于国际粮农组织( FAO) 和世界卫生组织( WHO) 2001 年公布的食品法典委员会( CAC) 中赖氨酸含量要求( 5. 5%) 。赖氨酸是人和畜禽必需的营养物质，如果小麦面粉中赖氨酸的含量增加0. 2%，其可利用蛋白质就增加 60%［2］。因此，提高小麦籽粒中赖氨酸的含量，对提高小麦单位食物量的营养价值具有重要意义，也是育种工作者的目标之一。但小麦赖氨酸的含量在不同品种间和种内的变化均较小［3］，通过品种间杂交和远缘杂交获得小麦高赖氮酸品系的潜力很小。近年来，随着小麦基因工程技术的发展，为利用外源高赖氨酸蛋白基因改良小麦的营养品质提供了新的途径。其策略是将编码富含氨基酸的异源蛋白质基因或将赖氨酸的合成与分解代谢途径中关键酶基因导入小麦，让该基因表达并积累到一定水平从而提高小麦贮藏蛋白的氨基酸组成或种子中赖氨酸的含量。孟超敏等［4］首次利用基因枪法将来源于四棱豆高赖氨酸蛋白基因 wblrp 和赖氨酸合成关键酶基因 dapA 导入小麦，获得的转基因植株种子赖氨酸含量提高了 10% 左右; 孙晓波等［5］将来源于辣椒花粉中高赖氨酸蛋白基因 Cflr 转入小麦品种扬麦 158 中，获得了赖氨酸含量提高的种质材料，最高的蛋白质中赖氨酸含量提高了22．9%。余桂红等［6］将 Cflr 基因导入到扬麦 16 中，获得了总蛋白和赖氨酸均提高的植株。这些研究结果表明，利用基因工程手段将外源高赖氨酸蛋白基因导入小麦来改良小麦籽粒品质是可行的。

　　高赖氨酸蛋白基因 Cflr 是从辣椒的花粉中克隆获得，其编码蛋白中赖氨酸含量高达 21． 2%，是迄今报道的赖氨酸含量最高的一个天然蛋白基因［7］。为更好地利用该基因，本研究以孙晓波等获得的转 Cflr 基因小麦株系为供体，拟通过杂交、回交和滚动回交的方法进行转育工作，结合分子检测、总蛋白及赖氨酸含量测定技术，从回交后代中筛选一批高赖氨酸含量的转基因新品系，为小麦营养品质的改良提供重要的种质资源。

　　1、材料与方法

　　1． 1、植物材料

　　15 个具有扬麦 158 背景的转高赖氨酸蛋白基因 Cflr 的小麦株系供体由江苏省农业科学院农业生物技术研究所提供; 长江中下游地区综合农艺性状优良的小麦品种扬麦 13、扬麦 15、扬麦 17、扬麦20、扬辐麦 4 号均为江苏里下河地区农业科学研究所提供。宁 0569 由江苏省农业科学院农业生物技术研究所提供。

　　1． 2、试验方法

　　1． 2． 1、回交及滚动回交转育程序 以转高赖氨酸蛋白基因 Cflr 小麦材料为供体亲本，以长江中下游农艺性状优良的扬麦 13、扬麦 15、扬麦 17、扬麦 20、宁 0569、扬辐麦 4 号为亲本进行杂交、回交或滚动回交，回交转育程序如图 1，共配制 13 个回交组合。

　　1． 2． 2、转基因小麦的分子鉴定 取各组合每代小麦少量幼苗叶片，按照 CTAB 法提取基因组 DNA。

　　根据 Cflr 基因及 NOS 序列设计用于目标基因 PCR鉴定的特异引物 Cflr-F: 5'-GCCGGATCCATGGGTT-GTGGGGAATCAAAGC-3'; Cflr-R: 5'-GCCCTGCAGT-TAATCTGTTTTCAAATCTGTTG-3'。引物 预 期 PCR扩增产物长度为 650 bp。PCR 反应体系总体积为20. 00 μl。基因组 DNA 200 ng，10 × PCR 反应缓冲液 2. 00 μl ，正向、反向引物( 10 mmol/L) 各 0. 75μl，dNTP ( 10 mmol/L) 2. 00 μl，Taq DNA 聚合酶( 5U / μl) 0. 20 μl，加无菌超纯水至 20. 00 μl。PCR 扩增程序为: 95 ℃预变性 3 min; 95 ℃变性 30 s，58 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 60 s，33 个循环，72 ℃保温 10min; 10 ℃ 保存。PCR 反应结束后取 5. 00 μl 在 1%的琼脂糖凝胶上电泳检查扩增结果。

　　1． 2． 3、籽粒蛋白质和赖氨酸含量的测定 将各回交组合的转基因株( 品) 系及对照分别种植于大田，结合 PCR 检测结果，选取含目标基因的株( 品) 系进行籽粒总蛋白质含量与赖氨酸含量的测定。

图 1 回交转育程序示意图

　　1． 2． 3． 1、总蛋白含量的测定 选取有代表性的、风干的转基因株系和对照小麦品种成熟种子各 30g，用 Dicky-John 近红外分析仪测定其中的总蛋白含量。

　　1． 2． 3． 2、赖氨酸含量测定 采用茚三酮比色法［8］并稍加修改，反应体系采用柠檬酸钠缓冲液，还原剂采用氯化亚锡。测定过程: ①标准曲线的制作 取7 只洁净带塞试管，编号，分别加入 0 ml、0. 1 ml、0. 2ml、0. 4 ml、0. 6 ml、0. 8 ml、1. 0 ml 的 50 μg / ml 亮氨酸标准液，然后依次加入 2. 0 ml、1. 9 ml、1. 8ml、1. 6ml、1. 4 ml、1. 2 ml、1. 0 ml 的蒸馏水，混匀后再向每支试管内加入 2. 0 ml 4%碳酸钠溶液和2. 0 ml 0. 02g / ml 茚三酮试剂，摇匀后塞紧管塞，80 ℃ 保温 30min，用冷水冷却试管至室温; 再向每支试管内加95% 乙醇 4. 0 ml，混匀后于 530 nm 处测吸光值 A，以所得吸光值为纵座标，亮氨酸浓度为横座标，绘制标准曲线。②样品测定 称取烘干、粉碎的小麦粉0. 1 g，将样品置于研钵中，加入 1. 0 g 石英砂、4. 0ml 4% 碳酸钠溶液，充分研磨 5 min。将匀浆液转移至 50. 0 ml 锥形瓶，用 6. 0 ml 4% 碳酸钠溶液、6. 0ml 蒸馏水分两次洗涤研钵，一起并入锥形瓶，摇匀。

　　将提取液用滤纸过滤，收集滤液。将滤液用蒸馏水定容至 20. 0 ml，作为待测样品。吸取 4. 0 ml 待测样品加入洁净的试管中，然后加入2. 0 ml 0. 02 g/ml茚三酮试剂，摇匀后塞紧管塞，80 ℃保温 30 min，用冷水冷却试管至室温，再向试管内加 95% 乙醇4. 0ml，混匀后于 530 nm 处测吸光值 A，重复 2 次。

　　③赖氨酸含量计算: 赖氨酸含量( % ) = ［( X × 100× 1． 1) / W － C］× 100% 。上式中，X: 由标准曲线算得的亮氨酸含量( mg) ; W: 样品质量( mg) ; C: 样品中游离氨基酸含量( %) 。

　　2、结果与分析

　　2． 1、Cflr 基因转育株系的筛选

　　为确保目标基因能导入各回交亲本中，利用Cflr-F 与 Cflr-R 特异引物对每代回交材料进行PCR 检测以追踪目标基因，最终在与扬麦 13 、扬麦 15 和扬麦 17 共 4 个杂交、回交组合的 BC3F2代共 257 株 中 检 测 到 含 目 标 基 因 的 44 株( 17. 12% ) ; 与扬麦 20、宁 0569 和扬辐麦 4 号滚动回交的 BC2F2代共 531 株中检测含目标基因的76 株( 14. 31 % ) ( 表 1 ，图 2 ) 。图 2 结果显示，质粒阳性对照扩增出 650 bp 的 Cflr 基因特异片段，阳性转基因植株也能扩出相同大小的条带，而非转基因植株及清水对照没有扩增带，表明高赖氨酸蛋白基因 Cflr 已成功转育，且在各回交后代稳定遗传。

表 1 回交转育组合 Cflr 基因检测结果

图 2 部分回交后代 Cflr 基因的 PCR 检测

　　2． 2、Cflr 基因转育株系籽粒总蛋白含量与赖氨酸含量分析

　　选择 Cflr 基因转育后代 PCR 鉴定为阳性且综合农艺性状优良的 40 个株系共 240 个单株的种子磨粉，测定其总蛋白和赖氨酸含量，结果显示( 选取部分株系进行分析，表 2) : 与被改良亲本相比有 28 个( 占全部株系的 70． 0% ) 转育株系的总蛋白质含量高于相应被改良亲本对照，15个达显着差异水平，其中 1-1、1-7、2-3、2-10、3-3 、3 -6 、6 -2 、6 -5 、7 -6 、8 -4 、9 -3 、9 -5 共 12 个株系的增幅在 10. 00% 以上，最高的株系 3-6( 扬麦 153/P79 -nr71 -2 组合) 籽粒总蛋白含量达 16. 40 % ，比扬麦 15 增加了 29. 13% 。23 个株系( 占全部株系的 57. 5% ) 的赖氨酸含量高于相应被改良亲本受体，其中，有 13 个株系赖氨酸含量达到了干种子的 0. 40% 以上，与所有亲本对照相比均达极显着差异水平，增幅最高的株系 3-6 赖氨酸含量比亲本对照提高了 38. 89% 。而在所有检测的 40 个阳性转基因株系中蛋白质和赖氨酸均有所提高的株系有 13 个，其中 6 个株系( 1-7、2-3、3 -3 、3 -6 、6 -2 、7 -6 ) 的赖氨酸含量提高了 22. 00 %以上，蛋白质含量提高了 10. 00% 以上。检测结果也显示，有 9 个株系赖氨酸或总蛋白含量下降，可能原因是转基因沉默造成检测结果与分子鉴定结果不一致。

表 2 部分转 Cflr 基因小麦株系的蛋白质含量和赖氨酸含量

　　2． 3、转基因株系产量性状

　　对转基因转育后代经分子鉴定、总蛋白含量和赖氨酸含量测定并经系谱法选择，获得 6 个总蛋白含量与赖氨酸含量均较高且农艺性状优良的转 Cflr基因株系，并对此 6 个株系进行了产量比较试验，结果( 表 3) 表明，有两个株系( 2-3 和 3-6) 表现优异，其主要农艺性状均达到或优于当地大面积推广品种扬麦 15，平均产量分别达 7 380 kg/hm2和 7 456kg / hm2，比对照扬麦 15 分别增产 3. 2% 和 4. 3%，其他转基因株系产量与对照相比无显着性差异。

表 3 转 Cflr 基因株系产量的测定

　　3、讨 论

　　赖氨酸是人体不能自身合成，必须从膳食中获取的八大限制性必需氨基酸之一。小麦为包括中国在内的全世界人口的重要食物，常规小麦品种籽粒中赖氨酸含量较低，远不能满足人体对赖氨酸的需要。由于不同小麦品种的赖氨酸含量都较低，因此很难通过传统的品种间或远缘物种间杂交方法提高小麦的赖氨酸含量。为了提高赖氨酸缺乏作物的营养品质，科研人员尝试用基因工程的方法来提高植物的赖氨酸含量，孙学辉等［9］将来源于四棱豆高赖氨酸蛋白基因 wblrp 和赖氨酸合成关键酶基因 dapA导入玉米中，使玉米种子中赖氨酸含量提高了16% 。高越峰等［10］同样将 wblrp 基因和玉米 ubiqu-tin 强启动子结合，用基因枪法导入水稻，使转基因水稻叶片中赖氨酸提高了16. 04%。郎志宏等［11］将马铃薯的高赖氨酸蛋白新基因 SBgLR 转入玉米中，其转基因种子中蛋白质提高了 5. 40% ～ 58. 10%，赖氨酸提高了 3. 20% ～ 54. 80%。张秀君等［12］将马铃薯花粉特异性的富含高赖氨酸蛋白质基因sb401 导入玉米，转基因植株的籽粒中赖氨酸的含量提高了 10． 00% ～54． 00%，蛋白质含量也不同程度地提高。这些研究表明，虽然赖氨酸量提高程度不一，但是可以看出通过转基因技术提高作物赖氨酸含量的方法是可行的。

　　优良的转基因系不仅可以在完成安全性评价后直接应用于生产，同时可作为优良种质加以利用。

　　本研究中以长江中下游农艺性状优良的扬麦 13、扬麦 15、扬麦 17、扬麦 20、宁 0569、扬辐麦 4 号为亲本，利用以 15 个导入辣椒高赖氨酸蛋白 Cflr 基因转基因株系为供体，进行杂交、回交或滚动回交，结合分子标记鉴定、总蛋白含量和赖氨酸含量测定，筛选获得赖氨酸含量增加且农艺性状得到改良的稳定转基因新品系 2 个，为培育高赖氨酸的优质农作物新品种、中间材料提供了新途径。

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