1、前言

　　几丁质（N- 乙酰氨基葡萄糖线性聚物）是病原真菌细胞壁的主要成分，几丁质酶通过破坏病原真菌菌丝尖端新合成的几丁质，使病原真菌细胞壁中的几丁质降解；破坏细胞新物质的沉积，致使病原体死亡，且所产生的细胞壁碎片具有诱导作用，可激发寄主植物的抗病反应[1]。植物几丁质酶具有广泛的生理活性[2]，尤其在植物抗病方面具有重要作用[3]。

　　研究发现几丁质酶参与植物的发育调控：植物几丁质酶基因的表达具有组织特异性，参与了植物的发育调控。如几丁质酶参与了胡萝卜和云衫的体胚发育过程。几丁质参与共生作用：几丁质酶可以降解固氮菌的结瘤因子，Minic 等研究苜蓿中的几丁质酶对某些结瘤因子具有降解作用。所以几丁质酶通过控制结瘤因子水平来使植物与根瘤菌达到共生平衡，而不产生过量的根瘤。

　　此外，几丁质酶对结瘤因子的降解具有专化性，可能是决定根瘤菌的寄主专化性的因素之一[5]。本研究旨在通过构建几丁质酶表达载体制备几丁质酶，用于抗真菌等方面的相关研究。

　　2、材料与方法

　　2.1、实验材料

　　人参由吉林农业大学基因工程实验室培育。大肠杆菌菌株为 DH5-α，原核表达载体 pET-28a(+)、BL21 均是由吉林农业大学生命科学学院基因工程实验室保存。质粒小提试剂盒、ExTaq 酶、solutionI 连接酶、限制性内切酶、分子量标准DL-2,000 购自大连宝生物公司。异丙基 -β-D- 硫代半乳糖苷（IPTG）等均购自北京鼎国生物公司。植物基因组 DNA 小量提取试剂盒、DNA 切胶回收试剂盒及清洁试剂为美国 Axygene公司产品。引物和测序均由上海生工公司完成。

　　2.2、实验方法

　　2.2.1、人参 Gchi1 基因扩增

　　按 GenBank 中人参 GchiI 基因序列（GeneID:DQ532359）及 pET-28a(+) 原核表达载体的多克隆位点设计特异引物 , 并在引物两端分别加酶切位点。上游引物序列为 5' CAA TTA ggATCC ATg gCA TCT CAT TTg TCg 3’，含有 Xho Ⅰ酶切位点（下划线）。下游引物序列为 5' CTA TAT CTC gAg TCA CAC ATCgCT CTT gAT3’含有 BamH Ⅰ酶切位点（下划线）。采用上述引物进行PCR扩增反应，以人参cDNA为模板，反应程序如下：94℃预变性 8 分钟；94℃变性 30 秒，62℃退火 30 秒，72℃延伸30秒，35个循环；反应结束后用1%的琼脂糖凝胶电泳检测。

　　2.2.2 人参 Gchi1 基因原核表达载体的构建将纯化后的 PCR 产物用 XhoI 及 BamHI 进行双酶切，同时对 pET-28a(+) 质粒进行双酶切，然后进行去磷酸化处理，构建重组载体 pET-28a(+)-Gchi1。将此重组载体转化感受态大肠杆菌，筛选阳性克隆并进行 PCR 及酶切鉴定，将鉴定后质粒送至上海生工公司完成测序鉴定。

　　2.2.3、目的蛋白的诱导表达及检测

　　将含有表达载体 pET-28a(+)-GchiI 的大肠杆菌振荡培养至OD600=0.6 时，加入终浓度分别为 0.4、0.6、0.8 和 1.0 mM/L 的IPTG。30℃，200 rpm/min 振荡培养，诱导表达 5h 后，离心收集菌体，菌体以含 0.2mg/ml 溶菌酶和 10 mM DTT 的磷酸钠缓冲液 (20 mM， pH 7.2 ) 悬浮，反复冻融 4 次，以超声波破碎后的样品离心，收集上清液进行 PAGE 检测。

　　2.2.4、目的蛋白活性鉴定

　　目的蛋白对真菌的抑制采用透明圈法测定，将锈腐菌接种到 PDA 培养基，使其在 25℃下生长 1 周左右。用直径 1cm 沾有上清液的滤纸放到菌丝边缘，以沾有无菌水的滤纸为对照，一周之后观察生长情况。以平板上菌落周围抑菌圈的有无和大小确定菌株是否诱导表达几丁质酶，以及所产几丁质酶的活性。

　　3、结果

　　3.1、人参 Gchi1 基因扩增及重组表达载体 pET-28a(+)GchiI 的鉴定

　　经 PCR 扩增的 Gchi1 基因片段经过 1% 琼脂糖凝胶电泳检测，结果图 1A 显示能够扩增出 897bp 大小的特异核酸片段与预期相符。将构建的重组载体进行酶切鉴定后，能够获得约897bp 的大小的条带与预期结果相一致，结果见图 1B。将菌落PCR及双酶切检测均呈阳性的pET-28a(+)GchiI质粒进行测序，测序结果表明 pET-28a(+)GchiI 重组载体构建正确，且具有正确的读码框。

图1 Gchi1 基因的扩增产物及载体鉴定

　　A：Gchi1 基因 PCR 产物凝胶电泳 M1：DL2000 Marker，1. 阳性扩增产物 2. 阴性对照

　　B：pET-28a(+)GchiI 质 粒 双 酶 切 鉴 定 M2：DL2000Marker，3. BamHI 和 Xho Ⅰ双酶切鉴定 4. pET-28a(+)GchiI 重组质粒

　　3.2、目的蛋白的诱导表达及检测

　　在 E.coliBL21(DE3) 中，经 IPTG 诱导，相对于未诱导菌株对照，经 SDS-PAGE 分析表明 pET-28a(+)-GchiI 经不同浓度的 IPTG 诱导后，均可明显表达约 34KDa 的特异蛋白，IPTG浓度为 0.6 mol/L 时，表达效果最佳。

图 2 IPTG 诱导表达目的蛋白 SDS-PAGE 分析

　　M: 蛋白 Marker ,1-2: 未诱导的重组质粒 3：0.4mol/LIPTG诱导

　　4：0.6 mol/LIPTG 诱 导 5：0.8 mol/LIPTG 诱 导 6：1.0mol/LIPTG 诱导

　　3.3、表达蛋白对真菌的抑制作用

　　重组 E.coliBL21(DE3) 菌株经 0.6mmol/L IPTG 诱导表达之后，经透明圈法测定，沾有无菌水的 A C E 滤纸处锈腐菌正常生长，沾有粗酶液的 B D F 滤纸处锈腐菌生长受到抑制，表明表达蛋白对锈腐菌有一定的抑制效果（图 3），提示本研究表达几丁质酶具有抑菌活力。

图 3 人参几丁质酶抑菌结果

　　4、讨论

　　植物几丁质酶具有广泛抗细菌、真菌、抗虫等生物学作用。ClassIII 类几丁质酶大多为兼具几丁质酶 / 溶菌酶的双功能酶，可分解细菌细胞壁的肽聚糖，对细菌产生影响。实验证明提纯的烟草、马铃薯、黄瓜。菜豆、豌豆、鹰嘴豆、甜菜、水稻、小麦、大麦、玉米等的几丁质酶对 20 多种真菌的菌丝生长或孢子萌发具有抑制作用，如灰色葡萄孢 Botrytis cinerea[6]、立枯丝核菌 Rhizoctonia solani[7]、绿色木霉菌 Trichoderma viride[8]、T.reesei[9]、串珠镰刀菌 Fusarium solani 等。在 AM 共生体中，共生相关的几丁质酶能降解有丛枝菌丝释放的几丁质片段，进而组织防御反应的诱导。Salzer 等在讨论苜蓿菌根中由 AM 真菌特异诱导的 ClassIII-2，ClassIII-3 几丁质酶功能时，认为菌根定殖后期阶段 ClassIII 几丁质酶的表达与植物防御反应的抑制有关，几丁质酶水解真菌释放的诱导物，使防御反应变弱，从而促进 AM 真菌与寄主植物间共生关系的建立。本研究表达的 ClassIII 几丁质酶具有抑制真菌的活性功能，可通过微生物发酵的方式获得大量活性抑菌几丁质酶物质。因此，开展人参几丁质的基因工程研究对培育抗病植物品种，提高作物抗病性具有重要意义。

　　参考文献
　　[1] 陈崇顺 , 朱雪峰 , 郁志芳 . 豇豆几丁质酶纯酶液对不同真菌的作用[J]. 植物保护学报 , 2000, 27(4): 375-376.
　　[2] Ding Xuezhi, Luo Zhaohui, Xia Liqiu, et al. Improving the insecticidalactivity by expression of a recombinant cry1Ac gene with chitinase-encoding gene in acrystalliferous Bacillus thuringiensis[J]. Currentmicrobiology, 2008, 56(5): 442-446.
　　[3] Tokunaga Takaaki, Esaka Muneharu. Induction of a novel XIP-typexylanase inhibitor by external ascorbic acid treatment and differentialexpression of XIP-family genes in rice[J]. Plant and cell physiology, 2007,48(5): 700-714.
　　[4] Kragh Karsten M, Hendriks Theo, de Jong Anke J, et al. Characterzationof chitinases able to rescue somatic embryos of the temperature-sensitivecarrot variantts11[J]. Plant molecular biology, 1996, 31(3): 631-645.
　　[5] Fenino Elena. Genetic Dissection of Organellar-Translation-DependentRetrograde Signalling in Arabidopsis[D]. lmu, 2010.
　　[6] Pocock Kenneth F, Hayasaka Yoji, McCarthy Michael G, et al.Thaumatin-like Proteins and Chitinases, the Haze-Forming Proteins ofWine, Accumulate during Ripening of Grape (Vitis v inifera) Berries andDrought Stress Does Not Affect the Final Levels per Berry at Maturity[J].Journal of agricultural and food chemistry, 2000, 48(5): 1637-1643.
　　[7] Muthukrishnan S, Liang George H, Trick Harold N, et al. Pathogenesis-related proteins and their genes in cereals[J]. Plant Cell, Tissue and OrganCulture, 2001, 64(2-3): 93-114.
　　[8] Mauch Felix, Mauch-Mani Brigitte, Boller Thomas. Antifungal hydrolasesin pea tissue II. Inhibition of fungal growth by combinations of chitinaseand β-1, 3-glucanase[J]. Plant Physiology, 1988, 88(3): 936-942.
　　[9] ANDERSEN M, JENSEN Arne, ROBERTUS J, et al. Heterologousexpression and characterization of wild-type and mutant forms of a 26 kDaendochitinase from barley (Hordeum vulgare L.)[J]. Biochem. J, 1997, 322:815-822.

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