摘    要：　湖北省荆门市某特禽养殖场饲养的4周龄七彩山鸡雏鸡出现缩头闭目、啰音、轻微咳嗽、食欲不振、排水样白色粪便等症状, 剖检可见肾脏肿大, 气管有散在出血点。提取气管、肺脏、肾脏组织总RNA, 用6个碱基长度的随机引物进行反转录, 并用针对传染性支气管炎病毒N基因和3′末端的非编码区的特异性引物进行PCR检测。结果表明:在约1 200 bp和290 bp处各有一条特异性条带, 结合发病情况和临床症状, 诊断该雏鸡所患疾病为鸡传染性支气管炎。使用自配3种中药方剂进行治疗与调理, 均取得了较好疗效, 有效地控制了疫情。说明七彩山鸡雏鸡患有肾病型传染性支气管炎, 3种自配的中药方剂均对本病有较好的治疗效果。

　　关键词：　七彩山鸡; 传染性支气管炎; 肾脏; IBV; 诊断; 中草药;
 

　　Abstract：　Four-week-old colorful pheasants raised in a special poultry farm in Jingmen, Hubei Province showed the symptoms of shrinking head and closing eyes, rales, mild cough, loss of appetite and drainage of white faeces. Anatomical findings showed that the kidneys were swollen and the trachea was scattered at the bleeding point. Total RNA was extracted from the trachea, lung and kidney tissues, reverse-transcription was carried out with random primers of 6 bases in length, and PCR was performed using specific primers designed according to the N gene and 3′ UTR of infectious bronchitis virus. A specific band each about 1 200 bp and 290 bp had been amplified. Combined with the incidence and clinical symptoms, it can be confirmed that colorful pheasants were suffering from avian infectious bronchitis. Treated with three kinds of Chinese herbal medicine, the diseased chicken have achieved good efficacy, and the epidemic situation has been effectively controlled.

　　Keyword：　colorful pheasant; infectious bronchitis; kidney; IBV; diagnosis; Chinese herbal medicine (020) ;

　　随着生活水平的不断提高, 人们的食品保健意识逐渐增强, 对肉品的需求由数量转向质量, 更注重追求野味、回归自然, 促进了我国特禽养殖业的迅猛发展[1,2]。

　　七彩山鸡又称环颈鸡、稚鸡, 因肉质细嫩鲜美、野味浓郁、蛋白质含量高、脂肪含量低、富含人体所需的全部氨基酸等特点[3,4,5], 受到广大消费者的青睐, 人工养殖规模迅速扩大, 饲养方式多以家庭散养为主。由于饲养人员大多未经过专业培训, 缺乏饲养管理经验, 饲养密度大, 管理不科学;生长环境改变, 致使七彩山鸡免疫力降低;春秋季节昼夜温差大, 鸡群机体免疫力下降等原因, 导致七彩山鸡极易发生各种疾病, 给养殖户带来巨大的经济损失[6]。

　　2017年3月份湖北省荆门市某养殖户饲养的1 000只4周龄七彩山鸡出现缩头闭目、打喷嚏、伸颈、张口呼吸、排白色水样粪便等症状, 随后死亡, 经剖检与RT-PCR检测, 确诊为鸡传染性支气管炎。使用自配的3种中草药治疗与调理, 7 d后群鸡取食量恢复正常, 啰音、咳嗽等症状消失, 无新增病例, 疫情得到有效控制, 现将诊治方法报道如下, 以期为该病的诊治提供参考。

　　1、 病例基本情况

　　湖北省荆门市某养殖户养殖的七彩山鸡4周龄时约35%出现精神萎靡、垂翅挤堆、食欲不振、气管啰音症状, 当日死亡约42只, 死亡率约4.2%。观察送检鸡发现其精神不振、缩头闭目、双翅低垂、怕冷扎堆、张口呼吸, 粪便为白色稀粪。

　　2、 检查与诊断

　　2.1、 临床诊断与处理

　　询问发病情况, 观察、记录送检鸡临床症状;选择症状严重的鸡进行剖检, 观察、记录呼吸系统及心脏、肝脏、脾脏、肾脏等组织器官的病变情况及病理变化, 取病变组织置于液氮中保存, 备用。

　　2.2、 剖检病变结果

　　剖检可见病鸡肾脏明显肿大、气管黏膜表面可见少量出血点, 泄殖腔内充满白色稀粪。

　　2.3、 RT-PCR鉴定

　　2.3.1、 分子生物学试剂 premix Taq、Ribonuclease Inhibitor、pMD18-T vector、6

　　个碱基的随机引物5′d (NNNNN) 3′等, 购自宝生物工程 (大连) 有限公司;反转录试剂M-M LV Reverse Transcriptase, 由Promega公司提供;TRIzol Reagent、胶回收试剂盒, 由Invitrogen公司提供。IBV检测用PCR引物为IBV N基因和3′UTR特异性引物, 目的片段大小为1 230 bp和290 bp。引物序列为:Nx 5′ -TTGAATTCATGGCAAGCGGTAAGGCA-3′, Ns 5′ -GCGTCGACCTCAAAGTTCATTCTCTC-3′ [7];3′ s 5′ -GGAAGATAGGCATGTAGCTT-3′, 3′x 5′-CTAACTCTATACTAGCCTAT-3′[8]。

　　2.3.2、 RNA提取及反转录

　　RNA提取采用TRIzol法, 操作按照说明书进行。cDNA合成采用6个碱基的随机引物5′d (NNNNN) 3′按照反转录试剂盒M-M LV Reverse Transcriptase说明书操作, 反转录产物即为进一步进行PCR扩增的模板。

　　2.3.3、 病毒PCR检测

　　用引物Nx/ Ns和3′s /3′x对病鸡气管、肺脏和肾脏组织所提取的RNA反转录产物进行PCR检测, PCR扩增体系为premix Taq 12.5 μL, 模板cDNA 5 μL, 3′s 和3′x (20 pmol/μL) 各0.5 μL, 灭菌去离子水补足至25 μL。扩增条件为94 ℃预变性3 min;94 ℃变性 40 s, 53 ℃退火 30 s, 72 ℃延伸 40 s, 30个循环; 72 ℃终延伸7 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测, 结果从病鸡肾脏组织样本中分别扩增出约1 200 bp和290 bp的特异性条带 (见图1) 。

　　图1 RT-PCR检测结果

　　A IBV病毒3′UTR RT-PCR检测结果 B IBV病毒N基因RT-PCR检测结果 M. DL-2 000 Marker; 1, 5.阳性对照; 2～4, 6～8. 分别为病鸡肾脏、肺脏、气管样品。

　　3、 治疗

　　3.1、 方案

　　将剩余958只七彩山鸡分成4组, 每组单独饲养, Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组各300只, 分别用中药方剂1, 2, 3治疗, 剩余58只饮用清水作为对照。鸡舍做好保暖工作, 并注意通风, 及时清理粪便, 每隔1 d用新洁尔灭进行全面消毒。中药方剂如下。

　　方剂1:板蓝根250 g, 连翘210 g, 金银花90 g, 甘草300 g;方剂2:麻黄180 g, 皂荚120 g, 黄芩216 g, 甘草300 g;方剂3:鱼腥草90 g, 蒲公英90 g, 大青叶300 g, 甘草300 g。各方剂分别水煎取汁6 kg (300只鸡的用量) , 候温饮用, 1次/d, 连用5 d。

　　3.2、 鸡群用药效果

　　根据诊断结果, 用3种中药方剂配伍煎汁, 供鸡群饮用, Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组用药后第3天死亡率降至0.4%, 5 d后无死亡, 鸡采食量增加, 精神较之前有所恢复, 病情基本得到控制, 治疗效果见表1、表2。

　　表1 用药后临床症状 导出到EXCEL

 

　　服药时间/d Ⅰ组 Ⅱ组 Ⅲ组 对照组

　　1、 鸡群打喷嚏症状减轻, 精神仍然沉郁, 厌食症状有所缓解 少数鸡群仍有打喷嚏症状, 精神仍然沉郁 少数鸡群仍有打喷嚏症状, 精神仍然沉郁 打喷嚏症状, 精神沉郁, 厌食

　　3、 打喷嚏症状消失, 个别鸡有发呆现象, 饮食恢复 个别鸡有打喷嚏症状和发呆现象, 饮食恢复 少数鸡有打喷嚏症状和发呆现象, 饮食恢复 打喷嚏症状加重, 精神沉郁, 厌食

　　5、 打喷嚏症状消失, 精神状态良好, 饮食恢复 打喷嚏症状消失, 精神状态良好, 饮食恢复 个别鸡仍有打喷嚏症状, 精神状态良好, 饮食恢复 打喷嚏症状加重, 精神沉郁, 厌食

　　7、 打喷嚏症状消失, 精神状态良好, 饮食恢复 打喷嚏症状消失, 精神状态良好, 饮食恢复 打喷嚏症状消失, 精神状态良好, 饮食恢复 打喷嚏症状加重, 精神沉郁, 厌食

　　表2 鸡群用药效果 导出到EXCEL

　　组别  1 d 3 d 5 d 7 d

　　死亡数/只 死亡率/% 死亡数/只 死亡率/% 死亡数/只 死亡率/% 死亡数/只 死亡率/%

　　Ⅰ组 9 3.00 1 0.33 0 0 0 0

　　Ⅱ组 10 3.33 2 0.67 0 0 0 0

　　Ⅲ组 12 4.00 4 1.33 1 0.33 0 0

　　对照组 4 6.90 5 8.62 5 8.62 6 10.34

　　4、 讨论

　　禽传染性支气管炎病毒 (infectious bronchitis virus, IBV) 是一种具囊膜的单股正链RNA病毒[9], 该病毒引发的禽传染性支气管炎可导致胚胎发育畸形, 雏鸡生长发育迟缓, 蛋鸡产蛋数量和品质下降, 是目前危害禽养殖业的主要疫病之一[10], 近几年在我国以肾病型日趋多见, 其在临床上表现为缩头闭目、双翅低垂、张口呼吸、粪便为白色稀粪等。

　　目前对IBV的检测和鉴定的方法很多, 主要有鸡胚分离鉴定病毒、致病性试验、致鸡胚矮小化试验、RT-PCR鉴定、核酸探针技术、单克隆抗体技术等。RT-PCR鉴定具有快速、操作简易、特异性强和敏感度高等特点, 是目前最为常用的病原快速诊断方法。通过对不同血清型IBV的核苷酸、氨基酸序列比对分析, 发现基因突变主要发生在S蛋白上[11]。本试验所用的2对引物分别针对位于传染性支气管炎病毒基因组的N基因和3′末端的非编码区, 这两个基因区间保守性强, 可以较好地用于IBV的分子检测。2017年3月份湖北荆门某养殖户送检的病鸡临床症状、剖检病变与鸡支气管炎肾病型的症状相符, 病鸡肾脏、气管和肺脏组织样本用IBV N基因和3′末端的非编码区的特异性引物进行PCR检测, 均呈阳性, 病鸡确诊为IBV感染。

　　在家禽养殖业中, 人们普遍采用疫苗来预防各种病毒病, 由于病毒具有变异快的特点, 导致预防成本高, 而且效果差强人意。中草药是兼有营养和药用双重功效, 无残留、无抗药性的天然药物, 能够增强机体免疫力, 且我国中草药资源丰富, 价格低廉, 目前已经发现多种中药具有较好的抗病毒效果, 如板蓝根对甲型流感病毒、乙型肝炎病毒、腮腺炎病毒等具有抑制感染和增殖的作用;鱼腥草对冠状病毒MHV-3感染具有很好的治疗效果;麻黄、甘草、蒲公英、三七、大青叶等能直接灭活或抑制病毒增殖;黄芪、菟丝子、当归、虫草等能通过诱导干扰素的产生或提高机体免疫力来达到抗病毒效果。中药主张复方用药, 用两味或两味以上中药相配伍, 利用其在抗病毒方面的协同作用, 达到治疗的目的。目前广大兽医工作者也在致力于中药方剂治疗家禽病毒病的研究, 中草药治疗家禽病毒病具有很好的应用前景。

　　参考文献：

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　　[10]CAVANAGH D. Coronavirus avian infectious bronchitis virus [J]. Vet Res, 2007, 38 (2) : 281-297.
　　[11]陈明艳, 余娟, 潘耀谦, 等. 鸡传染性支气管炎病毒变异机制及致弱方法研究进展[J]. 动物医学进展, 2013, 34 (5) : 91-94.

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