四川省攀枝花市某羊场饲养山羊520只, 2018年初产羔450只, 羔羊出生10 d左右呈爆发性发病, 发病率100%。发病羊只主要为羔羊, 在患羊嘴角、口唇、鼻孔周围及口腔黏膜形成红斑、丘疹、脓疮、溃疡和结成菜花状增生物, 有的羊只体温升高、精神差、牙龈红肿, 口流涎、采食困难或者不采食, 患羊逐渐消瘦, 衰竭而死亡[1]。由于该场发病数量多、治疗不及时, 相继有62只患羊死亡。通过临床症状观察, 初步确诊攀枝花某羊场羔羊疑似羊口疮病毒感染, 然后运用半套式PCR方法对病料进行诊断, 确诊病原并向该羊场提供可行的治疗方案。

　　1、材料

　　1.1、病料

　　采集攀枝花某爆发疑似ORFV羊场病羊口唇部的痂皮6份。

　　1.2、主要试剂

　　动物病毒DNA提取试剂盒, DNA Mark D2000, 2×Power Taq PCR Master Mix、DNA纯化回收试剂盒、p GM-T载体、质粒提取试剂盒, 购自天根生物科技有限公司。

　　2、方法

　　2.1、引物的设计与合成

　　根据邓宇[2]的文献设计引物, 上游引物ORF-P1:CGCAAGCCCGAGATGGTAA;下游引物ORF-P2:CGA-GCCCCATGAAGGAAAA;上游引物ORF-P3:GATGAG-GACGAACGGCTGGTA, 提交上海捷瑞生物工程有限公司合成;参考该文献的半套式PCR方法对待检口唇部痂皮样品进行检测。

　　2.2、口疮病毒DNA的提取

　　取ORFV XC13株细胞毒株疫苗毒株在-30℃反复冻融3次, 12 000 r/min离心5 min;取上清备用。用生理盐水清洗临床组织病料, 用灭菌剪刀剪碎后, 放入组织匀浆机中充分匀浆, 收集匀浆液-30℃反复冻融2次, 12 000 r/min离心5 min, 取上清置-30℃冻存备用。取上清按动物病毒DNA提取试剂盒操作方法提取病毒DNA[2]。

　　2.3、羊口疮病毒的PCR鉴定

　　根据邓宇[2]的方法对6份DNA样品进行半套式PCR诊断。

　　2.4、PCR产物的纯化测序与鉴定

　　将上述鉴定正确的PCR产物用胶回收试剂盒进行回收纯化, 回收产物送上海捷瑞生物工程有限公司测序, 并对测序结果进行Blast比对。

　　3、结果与分析

　　采用半套式PCR对6份痂皮样品进行扩增, 均获得大小为450 bp特异性扩增片段, 与预期扩增DNA片段大小一致 (图1) 。回收、纯化、克隆、测序所获得的DNA片段, 测序结果经Gen Bank中BLAST分析, 与ORF毒株的同源性达98%以上, 确诊病原为山羊口疮病毒。

图1 半套式PCR检测结果
 

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