摘要：雷索酸内酯类药物属于同化激素中的非甾类雌性激素, 具有改善生产性能的作用, 曾被多个国家广泛使用, 目前已被许多国家禁用。饲料中雷索酸内酯类药物存在的途径除了经不法分子非法添加外, 还可能因为饲料霉变产生。动物和人类通过食物链可能会发生药物蓄积现象, 从而带来很大的健康安全隐患。因此, 对其检测具有十分重要的意义。目前报道的生物样品及饲料中雷索酸内酯类药物检测方法较多, 气相色谱-质谱法和液相色谱-质谱法为其主流分析方法。

　　关键词：雷索酸内酯类药物; 残留分析; 检测方法;

　　Abstract：Resorcylic acid lactones (RALs) are non-steroidal estrogenic growth promoting compounds which have the effect of improving animal production. These compounds have been widely used in many countries before, but it is now banned in many countries; because of illegal addition of RALs to feeds or their being produce by fungal mildew in feeds, the accumulation of these drugs may occur in animals and humans through the food chain, and bring health risk to both of them. Therefore, it is of great significance to monitor the concentration of the harmful drugs in feed samples. Here we have reviewed the published analytical methods of detecting RALs in bio-samples and feeds, and have found that GC-MS and LC-MS/MS are two popular detection methods currently used.

　　Keyword：resorcylic acid lactones; residue analysis; detection methods;
 

　　雷索酸内酯类药物 (resorcylic acid lactones, RALs) 属于同化激素中的非甾类雌性激素, 主要化合物包括α-玉米赤霉醇 (zeranol, ZER) 、β-玉米赤霉醇 (β-taleranol, TAL) 、玉米赤霉烯酮 (zearalenone, ZON) 、α-玉米赤霉烯醇 (α-zearalanonle, α-ZOL) 、β-玉米赤霉烯醇 (β-zearalanonle, β-ZOL) 和玉米赤霉酮 (zearalanone, ZAN) [1]。该类药物有抗真菌、抗疟疾、抗菌、和/或抗癌等作用[2], 具有使用剂量低、促进蛋白质合成、增重、提高瘦肉率和提高饲料转化率等特点[3], 能使动物的生产性能得到改善, 产生很大的经济效益, 因此吸引了大量生产者使用。其中的玉米赤霉醇曾用于反刍动物, 作为生长促进剂。自人类发现玉米赤霉醇的促生长效果以来, 美国等几十个国家曾一度广泛使用, 美国从1969年就将其广泛应用于生长促进剂, 上世纪80年代末期, 我国也开始推广使用[4]。但后来发现雷索酸内酯类药物具有致癌、致畸和致突变作用, 对动物和人的健康产生影响。目前欧盟、美国等许多国家已严禁将该类药物用于家畜促生长;我国农业部第23号公告中也明确规定禁止将ZER用于所有食品动物, 所有可食性动物组织和动物尿液中均不得检出[5]。

　　雷索酸内酯类药物的主要使用方式是组织包埋, 也有极少数会通过饲料添加使用。此外, 除了人为使用外, 它还可能因为饲料霉变产生。雷索酸内酯类药物中的ZON、α-ZOL、β-ZOL等常常由霉菌代谢产生, 存在于霉变的玉米、小麦和大麦等谷类作物中。特别是玉米赤霉烯酮, 它是谷类食品和饲料的重要污染物, 在世界各地的玉米等作物中均有发现, 并受到世界各国食品和饲料安全部门的监控和密切关注[1]。

　　虽然政府禁止ZER等雷索酸内酯药物用作动物生长促进剂, 但由于玉米赤霉醇用量低、对动物增重效果好、经济回报高, 违法使用仍然存在。薛勇等[6]对家禽饲料中玉米赤霉烯酮污染情况进行了检测与分析, 发现3份饲料样品中玉米赤霉烯酮的含量为500μg/kg, 97份饲料样品中玉米赤霉烯酮的含量均≤500μg/kg。另外, 长期饲喂霉变饲料, 特别是少量不易发现有霉变的玉米, 会对家禽及家畜机体的免疫系统产生影响, 提高动物发病率, 导致动物生产性能降低, 或因并发症而死亡。为了保证动物性食品的安全和确保我国畜牧生产的健康发展, 研究建立生物样品及饲料中雷索酸内酯类药物的检测方法具有十分重要的意义。

　　1 雷索酸内酯类药物的检测方法

　　目前报道的雷索酸内酯类药物检测方法较多, 主要有薄层色谱法、高效液相色谱法、气相色谱法、液相色谱-质谱法、气相色谱-质谱法和免疫测定法等。刘震坤等[7]对饲料中玉米赤霉烯酮的生物学检测法、薄层色谱法等多种检测方法进行了综合研究;周妍等[8]也对玉米赤霉烯酮的常规检测方法和一些新型检测方法与技术以及相关研究进展进行了综述。

　　王宏杰等[9,10]研究了高效液相色谱法测定饲料中玉米赤霉烯酮的方法。使用的提取剂是甲醇和NaCl溶液, 用二氯甲烷进行三次萃取, 采用SPE小柱对药物进行比较纯化, 该检测方法的最低检测限为5μg/kg。对检测方法进行日内、日间加标回收试验时回收率约为96.3%。Amelin等[11]采用QuEChERS样品前处理方法, 同时使用了GC-电子俘获检测器, 对多种谷物、饲料以及肉中的玉米赤霉烯酮进行了分离测定, 以乙腈为提取液, 采用了分散液-液微萃取技术, 该检测方法的检出限为50μg/kg。Dincǎ等[3]采用液相色谱-电喷雾串联质谱法测定尿、肉、鱼、肝、肾样品中雷索酸内酯类药物的含量。萃取后经固相萃取小柱净化。该检测方法的CCα和CCβ为0.16~0.79μg/kg, 回收率为72.2%~119.7%。Wozniak等[12]采用液相色谱串联质谱法测定肌肉组织中的雷索酸内酯类药物, 用乙酸乙酯提取样品, 采用硫酸镁和醋酸钠分离水和有机相, SPE小柱净化, C18色谱柱分离。该检测方法的确定限 (CCα) 和检测容量 (CCβ) 分别为0.23~1μg·kg-1和0.39~1μg/kg, 回收率为83%~115%。Qian等[13]采用高效液相色谱-串联质谱法对水产品中所含有的玉米赤霉醇类激素药物的残留量进行了测定。提取液为乙腈, 利用正己烷脱脂, 之后使用氨基固相萃取柱进行净化。检测模式使用选择反应监测模式 (SRM) , 并采用外标法定量。该检测方法定量限为1.0μg·kg-1, 药物回收率为75.9%~103.8%。彭茂民等[14]采用乙腈-水为提取液, 利用三合一免疫亲和柱进行净化, 还使用了双通道荧光检测器串联光化学衍生器和二极管阵列检测器, 最后使用高效液相色谱法对小麦粉中黄曲霉毒素B1 (AFB1) 、玉米赤霉烯酮 (ZEN) 、脱氧雪腐镰刀菌烯醇 (DON) 进行了测定。该检测方法所测得的平均加标回收率为74.8%~105.2%。万宇平等[15]研制了的饲料中ZEN残留检测的ELISA试剂盒, 以50%甲醇为提取剂, 该检测方法的最低检测限为93.5μg·kg-1, 样品的回收率为74.5%~109.9%。王桂芳等[16]利用胶体金测试条对粮食中的ZEN进行快速定量测定, 该检测方法的检出限为5μg/kg, 定量限为14μg/kg, 采用配对t-进行检验, 与高效液相色谱法测定结果无显着差异。Urusov等[17]采用免疫层析系统对玉米赤霉烯酮进行检测, 该检测方法的检测时间为15 min, 检测限为0.1 ng/m L。Chen等[18]为了同时测定玉米、水稻和花生中三种真菌毒素开发了一种多重侧流免疫分析技术, 该检测方法中玉米赤霉烯酮的可视检测限为50μg/kg, 定量分析的检测限为0.42~0.46μg/kg。三种真菌毒素的平均回收率为86.2~114.5%, 变异系数小于16.7%。

　　气柏色谱-质谱法 (GC/MS) 方法为生物样品及饲料中雷索酸内酯类药物检测的经典测定方法之一。欧盟委员会残留基准实验室的Blokland等2006年报道了尿和肉样品中雷索酸内酯类药物GC/MS方法, 该方法采用负离子化学电离模式, 可用于对玉米赤霉酮进行定性分析和对另外五种雷索酸内酯类药物进行定量分析。文中表明, 欧盟早于FAIR5-CT-1997-3443计划中对食品中因非法使用造成玉米赤霉醇残留或来自食品中真菌毒素的污染而造成药物残留进行了区别鉴定。其后便着手开发对该类化合物的快速筛选和确证分析方法。Blokland等[1]在这一大背景条件下开发了基于两步净化的GC/MS分析方法。近年来欧盟指令2002/657中发布了有效的尿样中玉米赤霉醇GC/MS检测标准, 其CCα和CCβ分别如下:ZER为0.06~0.11μg/L;TAL为0.07~0.12μg/L;α-ZOL为0.07~0.11;β-ZOL为0.21~0.36;ZON为0.35~0.60μg/L;ZAN为0.19~0.33μg/L。张伟等[19]建立了牛肉组织中玉米赤霉醇及相关物残留的GC/MS法, 方法的检测限为1.0 ng/g。Shen等[5]建立了多种饲料中雷索酸内酯类药物的GC/MS法, 提取液为甲醇、采用乙酸乙酯萃取、以及正己烷除脂、之后采用固相萃取柱进行净化、衍生化后, 利用气相色谱质谱法进行检测, 方法的检测限均小于等于2.0 ng/g。以上文献表明, 研究建立检测限小于等于1.0 ng/g的该类药物GC/MS检测方法是切实可行的。

　　2 我国饲料中雷索酸内酯类药物的检测方法标准

　　我国有关饲料中雷索酸内酯类药物的检测方法标准有《农业部1486号公告-6-2010饲料中雷索酸内酯类药物的测定气相色谱-质谱法》、《GB/T 19540-2004饲料中玉米赤霉烯酮的测定》、《GB/T 28716-2012饲料中玉米赤霉烯酮的测定免疫亲和柱净化-高效液相色谱法》等。农业部1486号公告-6-2010规定了饲料中雷索酸内酯类药物的气相色谱-质谱检测方法。它适用于配合饲料、浓缩饲料和预混合饲料中α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、玉米赤霉烯酮和玉米赤霉酮的测定;对六种雷索酸内酯类药物的检测限均为2μg/kg, 定量限均为5μg/kg[20]。GB/T 19540-2004规定了玉米赤霉烯酮的薄层色谱测定方法和酶联免疫吸附测定法, 适用于配合饲料和饲用谷物原料中ZNE的测定。薄层色谱测定方法的最低检测量为20ng, 酶联免疫吸附测定方法的最低检测量为0.25ng[21]。GB/T 28716-2012规定了饲料中玉米赤霉烯酮含量的免疫亲和柱净化高效液相色谱的测定方法, 检测限为2μg/kg, 定量限为10μg/kg[22]。

　　3 小结

　　雷索酸内酯类药物对动物饲料的污染, 以及其通过食物链转移累积等, 将会对人类及畜禽的健康造成不同程度的威胁与伤害。由雷索酸内酯类药物与一些其他真菌毒素及药物等结构相似且在饲料中的含量有可能较低, 为了从源头上解决雷索酸内酯类药物的残留, 对饲料品质进行监控, 需要采用高准确度和精密度的定性定量方法。对雷索酸内酯类药物的检测已从最初的TLC、HPLC法, 发展到EIA、LC/MS、GC/MS法。随着科技的日益进步, 仪器设备的发展与更新, 饲料及生物样品中雷索酸内酯类药物的检测方法越来越多样化, 其中GC-MS和LC-MS/MS方法已经发展为最常用方法, 并不断成熟与普及。

　　参考文献

　　[1] Blokland M H, Sterk S S, Stephany R W, et al. Determination of resorcylic acid lactones in biological samples by GC-MS. Discrimination between illegal use and contamination with fusarium toxins.[J]. Analytical&Bioanalytical Chemistry, 2006, 384 (5) :1221-1227.
　　[2] Zhang Y, Dlugosch M, Jübermann M, et al. Total syntheses of the resorcylic acid lactone neocosmosin A and its enantiomer.[J].Journal of Organic Chemistry, 2015, 80 (9) :4828-4833.
　　[3] Dinca O, Tanasuica R, Albu H. Confirmatory method of resorcylic acid lactones in urine and tissue by liquid chromatography tandem mass spectrometry[J]. Scientific Works Series C. Veterinary Medicine, 2014, 60 (2) :81-88.
　　[4]张小帆, 侯玉泽, 胡骁飞, 等.动物性食品中玉米赤霉醇残留检测方法的研究进展[J].食品科学, 2014, 35 (07) :286-291.
　　[5] Shen J, Zhang S, Wu C, et al. Determination of SixResorcylic Acid Lactones in Feed by GC-MS[J]. Chromatographia, 2010, 71 (1-2) :163-165.
　　[6]薛勇, 姚学军, 刘洁, 等.家禽饲料中玉米赤霉烯酮污染情况的检测与分析[J].当代畜牧, 2014 (03) :34-35.
　　[7]刘震坤, 陈鲜鑫.饲料中玉米赤霉烯酮检测技术的研究[J].养殖技术顾问, 2014 (09) :212-213.
　　[8]周妍, 张圆圆, 刁晨曦等.玉米赤霉烯酮检测方法的研究进展[J].中国饲料, 2017 (16) :35-39.
　　[9]王宏杰, 徐剑宏, 祭芳等.饲料中玉米赤霉烯酮的提纯与测定[J].江苏农业学报, 2011 (03) :663-667.
　　[10]王宏杰.玉米赤霉烯酮降解菌的筛选、鉴定以及降解机理研究[D].南京:南京农业大学, 2011.
　　[11] Amelin V G, Karaseva N M, Tret'Yakov A V. Combination of the Qu EChERS method with dispersive liquid-liquid microextraction and derivatization in the determination of mycotoxins in grain and mixed feed by gas-liquid chromatography with an electron-capture detector[J]. Journal of Analytical Chemistry, 2013, 68 (6) :552-557.
　　[12] Wozniak B, Zuchowska I M, Zmudzki J. Determination of stilbenes and resorcylic acid lactones in bovine, porcine and poultry muscle tissue by liquid chromatography-negative ion electrospray mass spectrometry and Qu EChERS for sample preparation[J]. Joural of Chromatography B-analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences, 2013, 940:15-23.
　　[13] Qian Z, Liu Z, Deng W, et al. HPLC-MS/MS determination ofzeranols residues in aquatic products.[J]. South China Fisheries Science, 2011, 7 (1) :62-68.
　　[14]彭茂民, 刘丽, 王小飞, 等.免疫亲和柱净化-HPLC法测定小麦粉中的黄曲霉毒素B_1、玉米赤霉烯酮和脱氧雪腐镰刀菌烯醇的含量[J].食品科技, 2017 (09) :305-308.
　　[15]万宇平, 韩黎, 吴鹏, 等.玉米赤霉烯酮残留检测ELISA试剂盒的研制[J].江苏农业学报, 2013 (03) :659-663.
　　[16]王桂芳, 李培真, 曹阳, 等.胶体金测试条法对粮食中玉米赤霉烯酮快速定量测定的应用研究[J].粮食科技与经济, 2014 (01) :32-34.
　　[17] Urusov A E, Petrakova A V, Kuzmin P G, et al. Application of gold nanoparticles produced by laser ablation for immunochromatographic assay labeling[J]. Analytical Biochemistry, 2015, 491:65-71.
　　[18] Chen Y, Chen Q, Han M, et al. Development and optimization of a multiplex lateral flow immunoassay for the simultaneous determination of three mycotoxins in corn, rice and peanut[J]. Food Chemistry, 2016, 213:478-484.
　　[19]张伟, 王建平, 沈建忠, 等.牛肉组织中玉米赤霉醇及相关物残留的气相色谱-质谱法测定[J].畜牧兽医学报, 2007 (05) :513-517.
　　[20]中华人民共和国农业部.农业部1486号公告-6-2010_饲料中雷琐酸内酯类药物的测定_气相色谱-质谱法[S]. 2010.
　　[21]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局, 中国国家标准化管理委员会. GB/T 19540-2004饲料中玉米赤霉烯酮的测定[S]. 2004.
　　[22]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局, 中国国家标准化管理委员会. GB_T_28716-2012_饲料中玉米赤霉烯酮的测定_免疫亲和柱净化-高效液相色谱法[S]. 2013.

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