微生物是土壤中最活跃的生命因子，可通过多种方式降低土壤重金属的生物有效性和可迁移性，在土壤生态系统中承担着重要的生态功能。鉴于传统镉污染土壤修复方法的不足，利用土壤微生物原位修复重金属污染成为研究的热点。可通过向污染土壤中添加镉吸附性微生物，利用这些微生物的表面活性基团对重金属进行胞外沉淀、络合、胞内积累和氧化还原等作用，降低土壤中重金属镉的活性及农产品中的镉含量[1-9]。试验从严重镉污染土壤中取样，分离纯化了 1株具有较强镉抗性的菌株，并通过形态观察、生理生化及系统发育分析，研究了该菌株对镉和其他重金属的耐受性，旨在为探索开发更多高效、实用的土壤原位微生物钝化产品和生物吸附剂产品提供参考。

　　1、材料与方法

　　1.1、耐镉细菌菌株的分离和纯化

　　在湖南省重金属污染严重的土壤中，采用常规方法采集土壤样品 5 份，用于镉高固定微生物的分离、筛选。耐镉细菌菌株按照以下步骤分离和纯化 ：（1）将10 g 土壤加入到装有 90 mL 无菌水（含吐温 -80）的三角瓶中，摇床振荡 30 min，静止 20 min ；（2）用装有 4.5 mL 无菌水的试管梯度稀释 10-5~10-2；（3）按 2mmol/L 终浓度将镉溶液加入 LB 培养基中，制备平板；（4）平板冷却后，每个梯度取 200 μL 土壤浸出液涂布于平板上，重复 3 次（；5）待平板将液体完全吸收后，30℃恒温培养 ；（6）培养 2~3 d 后，挑取形态差异大、生长良好的菌落在含镉平板上划线纯化，将挑取划线培养的单菌落移入试管斜面保存备用。

　　1.2、耐镉细菌镉抗性驯化筛选

　　将细菌菌株活化，用接种环分区划线于含 2mmol/L 镉的 LB 平板上，28~30℃恒温箱中培养 3~5 d后，将生长良好的细菌转接到 4 mmol/L 镉的 LB 平板上，在后续培养中，依次递增镉平板浓度，重复上述实验。

　　1.3、菌株 LY29-1-5 的菌落、菌体形态观察

　　在固体培养基上观察 LY29-1-5 的菌落形态，在光学显微镜下进行菌体形态观察。

　　1.4、菌株 LY29-1-5 的生理生化分析

　　葡萄糖、麦芽糖、甘露醇等糖醇类的氧化发酵试验、吲哚试验、甲基红试验、V-P 试验、柠檬酸盐利用试验及硫化氢试验的具体方法均参照《伯杰氏细菌鉴定手册》（第 9 版）和文献[10]。

　　1.5、菌株 LY29-1-5 的鉴定

　　1.5.1、形态鉴定　将纯化的细菌划线接种于 LB 培养基上，30℃培养 72 h，观察菌落形态、大小、颜色、表面及边缘等特征。

　　1.5.2、分子鉴定　提取 DNA 后，对 16S rDNA 目的片断进行 PCR 扩增[11]

　　。引物序列：F，5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' ；R，5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。PCR 反应体系（50 μL）：去离子水 39 μL，PCR buffer 5 μL，dNTP 2 μL，上、下游引物各 l μL，基因组 DNA 1 μL，DNA 聚合酶 1 μL。PCR 反应条件 ：94℃预变性 4 min ；94℃变性 50 s，54℃退火 30s，72℃延伸 90 s，29 个循环。72℃终末延伸 10 min。

　　PCR 产物由生工生物工程（上海）股份有限公司进行序列测定。使用 MEGA5.2 软件构建系统发育树。

　　1.6、菌株对多种重金属的抗性试验

　　菌株活化后分别加入相应浓度（15、10、8、6、0.1和 0.09 mmol/L） 的 6 种 重 金 属（Cd2+、Zn2+、Pb2+、Cu2+、Hg2+、Ag+） 溶 液（ 分 别 由 CdCl2、Zn(NO3)2、Pb(NO3)2、CuCl2、HgCl2和 AgNO3配制），约 24 h 后取出，用比色法测定各重金属菌液的 OD600值。

　　2、结果与分析

　　2.1、耐镉菌株的梯度分离和驯化结果

　　用含 2 mmol/L 镉细菌培养基平板，分离到了150 个细菌菌株，经过驯化筛选到的 LY29-1-5 菌株，在 15mmol/L 的镉平板上能生长（图 1）。

图 1　菌株 LY29-1-5 的菌落形态 

　　2.2、细菌 LY29-1-5 的革兰氏染色、形态观察及生理生化试验结果

　　2.2.1、形态特征　菌株 LY29-1-5 在 LB 培养基上 28℃下培养 48h 后，菌落形态规则，湿润，不透明，粉红色。菌体杆状，最适生长温度 26~30℃，革兰氏染色为阴性。

　　2.2.2、生理生化特性　生理生化实验结果 ：吲哚实验和甲基红实验为阳性 ；V-P 实验、柠檬酸盐实验、产硫化氢实验为阴性 ；可利用葡萄糖、麦芽糖和甘露醇等碳源。

　　2.3、细菌 LY29-1-5 的 16S?rDNA 序列分析

　　由图 2 可知，可测定 LY29-1-5 菌株的 16S rDNA序列全长为 1 452 bp。将经测序得到的序列进行 Blast序 列 分 析，LY29-1-5 与 大 肠 杆 菌（Escherichia colistrain H1）的 16S rDNA 序列同源性达 96%。

图 2　细菌 LY29-1-5 的 16S rDNAPCR 结果 

　　2.4、细菌 LY29-1-5 的系统发育分析

　　随机选取同源性较高的 11 株细菌的 16S rDNA序列，与菌株 LY29-1-5 的 16S rDNA 序列进行系统发育分析，并构建系统发育树。由图 3 可知，菌株LY29-1-5 与大肠杆菌（Escherichia coli strain H1）具有较近的同源性。基于该菌株的菌体和菌落形态、生理生化分析，该菌株初步鉴定为大肠杆菌。

图 3　细菌 LY29-1-5 的 16S rDNA 序列系统发育树 

　　2.5　菌株 LY29-1-5 的多金属抗性分析多金属抗性分析结果表明，该菌株对 Hg2+和Ag+比较敏感，微量的 Hg2+和 Ag+存在时，该菌株的生长基本受到抑制 ；该菌株对 Cd2+和 Zn2+抗性较强，对 Pb2+和 Cu2+次之（图 4）。因此该菌株具有抗多种重金属的能力，这为菌株在复杂的土壤环境中的生存和繁殖提供条件。

图 4　细菌 LY29-1-5 对 6 种重金属的最低抑菌浓度 

　　3、结论与讨论

　　研究从湖南省极度重金属污染的土壤中利用高通量筛选技术分离、纯化到 1 株重金属镉高耐性菌株LY29-1-5，该菌株经菌体、菌落形态观察、分子生物学鉴定及系统发育分析，初步确定为大肠杆菌。经多种重金属的抗性分析发现，该菌株对多种重金属特别是土壤污染中常见重金属 Cd2+、Zn2+、Pb2+等均表现出不同程度的抗性水平。

　　近年来，随着重金属对土壤环境的污染加剧，其治理技术措施也面临巨大的挑战。在具体的实施过程中，不同的方法具有不同的优缺点。微生物体积小、比表面积大、繁殖速度快、代谢旺盛、种类多、容易培养、对环境有很强的适应性，是人类最宝贵的资源库。随着污染物的不断累积，微生物的种类和代谢类型呈现出多样性，微生物的形态结构和生理遗传优势使它们在污染物的降解转化、生态环境保护等方面具有巨大的潜力。因此，研究微生物资源的开发利用，探索开发更多高效、实用的土壤原位微生物钝化产品和生物吸附剂产品用于去除重金属具有重要的经济和社会意义。

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