摘  要：　为研究钼对鸡法氏囊形态及免疫功能的影响, 笔者选取2周龄健康公鸡80只, 随机分为5组, 分别为对照组、钼Ⅰ组、钼Ⅱ组、钼Ⅲ组和钼Ⅳ组, 饮水中添加不同剂量的钼酸钠 (以钼离子计) , 经过合理饲养, 在试验处理第7周采集鸡的法氏囊, 固定包埋处理后, 制得石蜡切片, 经HE染色和免疫组织化学分析法观察法氏囊组织形态学变化及黏膜相关分泌抗体水平。结果表明, 不同剂量的钼对鸡法氏囊组织形态学及黏膜相关分泌抗体水平影响差别很大。

　　关键词：　钼; 鸡法氏囊; 免疫功能; 免疫组织化学;
 

　　法氏囊是禽类特有的中枢免疫器官, 位于泄殖腔的背侧, 呈盲囊状, 是B淋巴细胞最早发生的场所。法氏囊组织结构最明显的特点是, 黏膜层固有膜中有许多淋巴上皮滤泡和与此有关的黏膜上皮的分化。由法氏囊产生的多种特异性淋巴B细胞先转化为浆母细胞, 后分化为浆细胞, 之后浆细胞合成、分泌抗体, 从而发挥体液免疫作用, 同时执行多种免疫功能。

　　钼常以Mo024-的形式存在于动物机体内, 是动、植物生长发育所必需的微量元素之一。适量的钼可降低食道癌、乳腺癌及心血管疾病的发生率, 具有抗氧化、缓解衰老、增强机体免疫力的作用。笔者通过添加不同剂量的钼来判断并评价对鸡法氏囊形态及免疫功能的影响, 为钼在畜禽方面的合理应用及系统研究钼对禽法氏囊的影响提供理论依据;为畜禽疾病的防治和科学饲养提供依据。

　　1、 材料与方法

　　1.1、 材料

　　1.1.1、 主要仪器及设备

　　SZ-97自动三重纯水蒸馏器, 京制电子天平, KD-T电脑生物组织烤片机, KD-BM生物组织包埋机, 生物组织切片机, 双层铁皮电炉 (A型) , 显微镜 (XS-212-103) , 数显鼓风干燥箱。

　　1.1.2、 主要试剂

　　钼酸钠、多聚甲醛、苏木素、甲明矾、伊红、氯化钠、枸橼酸、枸橼酸三钠、乙醇 (分析纯) 二甲苯 (分析纯) 、Ig A单克隆抗体、30%双氧水、SABC免疫组化试剂盒, DBA显色试剂盒、磷酸氢二钠, 磷酸二氢钠。

　　1.2、 方法

　　1.2.1、 动物分组与处理

　　选取2周龄健康蛋公鸡80只, 随机分为5组, 每组16只, 在饮水中添加不同剂量的钼酸钠, 建立试验模型, 分别为正常对照组、钼Ⅰ组、钼Ⅱ组、钼Ⅲ组和钼Ⅳ组。在试验处理第7周收集鸡法氏囊组织。

　　1.2.2、 动物组织切片的制作

　　1.2.2. 1、 取材与修块

　　心脏采血后处死鸡只, 无菌条件下立即采集鸡的法氏囊。修整组织块时以3 mm~5 mm×3 mm~5 mm×10 mm~15 mm为宜。

　　1.2.2. 2、 固定与冲洗

　　采集的组织及时投入固定液进行固定, 做好标记。固定液用量一般为组织块体积的10倍~20倍。组织固定24 h, 每8 h换1次固定液。固定后加入PBS (p H值=7.4) 洗去多聚甲醛。

　　1.2.2. 3、 修块

　　固定后的组织用70%酒精稍加清洗后修切, 选择好包埋部分。

　　1.2.2. 4、 脱水

　　在室温下将脱水剂配成不同的梯度浓度, 将组织块置入其中逐级进行脱水。本试验采用70%、80%、90%、95%各2 h, 100% (Ⅰ) 、100% (Ⅱ) 各1 h的酒精。

　　1.2.2. 5、 透明

　　使用二甲苯透明。过程是100%酒精和二甲苯 (1∶1) 25 min、二甲苯 (Ⅰ) 15 min、二甲苯 (Ⅱ) 15 min。

　　1.2.2. 6、 浸蜡

　　组织块经透明之后, 在恒温设备中进行浸蜡。笔者选用溶点为58℃~60℃的石蜡。将恒温箱调至60℃。选用1∶1的二甲苯与石蜡混合液进行预处理30 min (60℃) , 然后浸入纯石蜡 (Ⅰ) 2 h、纯石蜡 (Ⅱ) 2 h。

　　1.2.2. 7、 包埋

　　将已浸过的组织块置入已溶化的石蜡纸盒内, 使蜡块迅速冷却硬固。

　　1.2.2. 8、 石蜡块的整修

　　将多余的石蜡修掉, 使石蜡块上下两面形成平等的面, 将组织四周的蜡层遗留≥2 mm。

　　表1 在饮水中添加不同剂量的钼酸钠

　　1.2.2. 9、 切片与展片

　　将切片刀与组织块成5°夹角, 切片厚度为5μm。刚开始使用旧刀片, 待修至组织切片均匀平展时换上新刀片, 开始切片。将切片置于60℃温水中展片。

　　1.2.2. 1 0、 贴片及烤片

　　待石蜡切片边沿的蜡开始融化时, 从水中捞取切片, 拨正位置, 控干水分, 然后放入温箱内烘干。

　　1.2.3、 HE染色

　　染色与于使组织或细胞的不同成分之间有明显的对比色, 以利于显微镜下观察。苏木精本身不是染料, 需经氧化以后形成氧化苏木精才有染色作用。

　　2、 结果

　　2.1、 钼对鸡法氏囊形态的影响

　　HE染色结果显示, 对照组法氏囊组织形态结构正常, 淋巴滤泡面积较大, 结构整齐, 髓质部有淋巴细胞丰富。在钼Ⅰ组中, 法氏囊淋巴滤泡体积较对照组有所增大, 淋巴滤泡之间排列更加紧密, 髓质内幼淋巴细胞更多。在钼Ⅱ组中, 法氏囊中淋巴滤泡之间排列比对照组更紧密, 淋巴滤泡面积增大, 髓质和皮质形态结构较完整。在钼Ⅲ组中, 法氏囊形态结构比较完整, 淋巴滤泡与对照组相比面积更大, 淋巴滤泡排列非常密集, 髓质内淋巴细胞丰富。在钼Ⅳ组中, 法氏囊中淋巴滤泡排列紊乱, 面积较对照组小, 髓质内淋巴滤泡减少。

　　2.2、 钼对鸡法氏囊黏膜SIg A的影响

　　SIg A是存在黏膜中的分泌型Ig A抗体, 可依颗粒多少及染色深浅判定阳性强度, 其阳性表达产物呈棕黄色颗粒状分布于黏膜中。正常对照组法氏囊切片中SIg A呈弱阳性反应;钼Ⅰ组法氏囊黏膜有特异性着色, 形成弱阳性着色带;钼Ⅱ组法氏囊组织切片中可见散在分布的棕黄色颗粒, 阳性产物多分布于法氏囊黏膜周围;钼Ⅲ组法氏囊组织切片中, 颜色加深的棕黄色颗粒分布于黏膜下层周围;钼Ⅳ组法氏囊组织切片中, 棕黄色颗粒在黏膜下层中不规则表达, 形成明显的着色带。

　　3、 分析与讨论

　　法氏囊是禽类体液免疫的中枢淋巴器官, 是B淋巴细胞最早发育的场所。法氏囊的结构给B细胞提供了一个有助于分化的环境。法氏囊是抗体发生和增殖分化的部位。骨髓的淋巴干细胞通过血液运输进入到法氏囊, 形成为淋巴B细胞, 转移至外周的淋巴器官组织并继续发育。当这些细胞受到抗原物质的作用后可迅速增生, 转变成为浆细胞并产生抗体。

　　3.1、 钼对鸡法氏囊形态的影响

　　鸡在自然条件下不会发生钼中毒。在试验中, 随着钼含量的增加, 钼在鸡体内的代谢加强, 而法氏囊的形态也随着钼的增加而不同。钼是动物必需的微量元素, 其生化功能通各种钼酶的活性来表现。钼酶参与蛋白质含硫氨酸和核酸的代谢。随着钼的增加, 钼酶活性增强, 从而促进法氏囊形态结构及功能的完善。当钼添加剂量为100 mg/L时, 大量的钼在体内蓄积, 导致营养失调, 从而影响法氏囊的形态和功能。

　　由此可见, 50 mg/L的钼添加量对法氏囊的形态发育影响最好。

　　3.2、 钼对鸡法氏囊免疫功能的影响

　　在低钼作用下, 钼酶的活性得到加强, 促进法氏囊的发育, 淋巴滤泡体积变大, 数量增多, 髓质内的幼淋巴细胞增多, 从而使法氏囊淋巴滤泡中成熟浆细胞的数量增多, 进而促进法氏囊黏膜Ig A分泌量的增加;而钼添加剂量为100.0 mg/L时, 对鸡法氏囊形态造成损伤, 使成熟的浆细胞大量溢出, 在黏膜下层分泌大量的Ig A。

　　4、 结论

　　试验结果表明, 低钼促进了法氏囊形态结构的发育, 使鸡法氏囊的淋巴滤泡面积增大、数量增多, 使髓质内的幼淋巴细胞增多, 法氏囊黏膜中成熟浆细胞分泌的SIg A增加, 从而使鸡免疫功能增强。但是, 当钼添加量为100.0 mg/L时, 对法氏囊形态及免疫功能有轻微损伤。

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