摘要

　　在畜禽粪便无害化处理过程中加入外源添加物可提高处理效率，也可提高肥效。本文以畜禽粪便无害化为研究目标，通过添加外源物质提高其处理效率，筛选最优淋洗剂、降解菌，经无害化处理后，分析其微生物多样性的变化，主要结论如下：

　　（1）在畜禽粪便无害化处理过程中分别添加壳聚糖、EDTA、柠檬酸钠，对畜禽粪便进行淋洗，分别检测淋洗液中 Cu、Zn、Pb、Cd 四种重金属含量，筛选最优淋洗剂。结果表明：在重金属 Cu、Pb、Cd 的去除上，EDTA 淋洗能力最强，淋洗五小时后总的去除率分别为 33.67%、54.66%、58.73%；在重金属 Zn 的去除上，壳聚糖淋洗能力最强，总的淋洗率达到 44.14%。从淋洗速度分析，三种淋洗剂中，壳聚糖在淋洗的前两个小时表现出明显优势，对 Cu、Zn、Pb、Cd 的去除率分别达到了 21.45%、39.51%、42.79%、40.53%。综上分析可知，壳聚糖在快速淋洗方面占优势，EDTA 在淋洗总量上占优势，在工艺生产中，可将两种淋洗剂结合使用达到较好的淋洗效果。

　　（2）无害化处理过程中纤维素降解菌株具有较好的应用前景。采用刚果红培养基直接分离筛选出纤维素降解能力较强的菌株 X-3，并对其进行形态学鉴定结果表现为杆状菌，具有运动性；生理生化分析结果表现为甲基红试验和柠檬酸盐利用都呈阳性，接触酶结果呈阴性，氧化发酵试验表现为氧化型，其中 5%盐度时菌株长势最好；对 X-3 菌株进行分子鉴定，将扩增后的序列进行测序，所获序列长度为 583 bp，运用 NCBI 数据库中的 BLAST 工具进行序列比对并运用 MEGA 7.0构建系统发育树，结合菌体的形态学鉴定及生理生化检测结果初步确定菌株 X-3为嗜麦芽窄食单胞菌。

　　（3）运用高通量测序技术，对样品中 16SrDNA V3-V4 区测序，比较不同外源添加物对畜禽粪便无害化处理后微生物多样性的变化。Alpha 多样性分析显示，抗生素降解菌和纤维素降解菌的同时使用增加了 T3 组的物种丰度，表明该生境更适宜多种微生物的同时生存，堆肥后无害化处理效果最好。在门分类水平上，共检测分类 38 个菌门，其中变形菌门占明显优势（41.3610%~ 45.0427%），其次为拟杆菌门、芽单胞菌门、放线菌门。在属分类水平上，共检测到 852 类菌属，其中未分类菌属、芽单胞菌属都是明显的优势菌属。同时绿弯菌门和放线菌门的存在也表明畜禽粪便在用作肥料时不仅可以提供肥效，而且能够净化土壤污染，降解农药残留，在资源化利用方面表现出优势。

　　关键词：畜禽粪便，重金属，纤维素降解菌，微生物多样性

Abstract

　　Adding exogenous additives in the process of harmless treatment of livestock andpoultry manure can improve the treatment efficiency and fertilizer efficiency. The aimof this paper is to study harmless feces of livestock and poultry, the treatment efficiencycan be improved by adding exogenous substances. The appropriate washing agent wasscreened, high efficiency cellulose degrading microorganisms. After harmless treatmentanalyze the change of microbial diversity. The main conclusions are as follows:

　　(1) Chitosan, EDTA, citrate sodium was added in the harmless treatment oflivestock and poultry feces to leach them. The contents of Cu, Zn, Pb and Cd in theeluent were determined and screen the best eluent. Experimental results show thatEDTA has the strongest leaching ability in the removal of Cu, Pb, Cd. After five hoursof leaching, the total removal rates were 33.67%, 54.66%, 58.73%. Chitosan had thestrongest leaching ability in the removal of heavy metal Zn, and the total leaching ratereached 44.14%. According to the analysis of the leaching speed, chitosan showedobvious advantages in the first two hours of leaching, and the removal rates of Cu, Zn,Pb and Cd reached 21.45%, 39.51%, 42.79% and 40.53%. In conclusion, chitosan issuperior in rapid leaching and EDTA is superior in total leaching amount. In processproduction, two leaching agents can be combined to achieve better leaching effect.

　　(2) Cellulose degradation bacteria has a good application prospect in the processof harmless treatment. The X-3 strain with strong cellulose degradation ability wasisolated by Congo red medium. The results of morphological identification showed thatbaculobacter spores were sporty; The results of physiological and biochemical analysisshowed that both methyl red test and citrate utilization were positive. The contactenzyme was negative. The oxidative fermentation test showed the oxidative type.Among them, 5% salinity showed the best growth rate; Molecular identification of theX-3 strain was carried out, and the amplified sequence was sequenced. The obtainedsequence length was 583 bp. BLAST tool in NCBI database was used for sequencecomparison and phylogenetic trees were constructed with MEGA 7.0. Combined with morphological identification and physiological and biochemical detection results of thebacteria, it was preliminarily determined that strain X-3 was stenotrophomonasmaltophilia.

　　(3) The V3-V4 region of 16SrDNA was sequenced using high-throughputsequencing technology to compare the changes of microbial diversity after harmlesstreatment of livestock and poultry feces with different exogenous additives. Alphadiversity analysis showed that the simultaneous use of antibiotic-degrading bacteria andcellulose degrading bacteria increased the species richness of group T3, indicating thatthe habitat was more suitable for the simultaneous survival of multiple microorganismsand the harmless treatment after composting had the best effect. At the phylumclassification level, a total of 38 phylum were detected, among which proteobacteriaaccounted for a significant advantage (41.3610%~45.0427%), followed by bacteroidetes, gemmatimonadetes and actinobacteria. At the level of genera classification, a total of852 genera were detected, among which the unclassified genera and the gemmatimonaswere the obvious dominant genera.At the same time, the existence of chloroflexi andactinobacteria also indicates that livestock and poultry manure can not only providefertilizer efficiency, but also purify soil pollution, degrade pesticide residues and showadvantages in resource utilization。

　　Key Words: livestock and poultry manure, heavy metal, cellulose degradingbacteria, microbial diversity

目录

　　第1章绪论

　　依据国家统计局统计2016年我国大牲畜11906.4×104头。其中，牛数达10667.9×104头；肉猪出栏量为68502×104头，年底存栏量为43503.7×104头；羊年底存栏30112.0×104只[1]。我国2007~2016畜产品产量变化统计结果如表1.1，肉类产量变化趋势如图1.1。我国的养殖业发展迅速，其规模和数量在全世界的排名上都名类前茅[2]，但是随着养殖业的发展，种养业之间的不断分离致使养殖废弃物的资源化利用程度也逐渐降低[3-5]，畜禽粪便的直接排放不但会污染环境，而且对人类健康也有所影响[6-7]，畜禽粪便的污染压力较大[8]。

　　1.1畜禽养殖废弃物排放与污染现状

　　1.1.1畜禽养殖废弃物排放现状

　　随着社会的发展，人口数量不断增加，人们对肉类、牛奶和蛋类的需求也不断增加。已经有研究发现，2005到2030年之间畜禽产品产量需增长2.5倍才能满足人们的基本需求[9]。畜牧业的快速发展在给人类带来了大量的畜产品的同时，大量的畜禽粪便也伴随而来，郑微微等（2017）研究发现江苏省从2006年开始到2014年畜禽粪便排放总量达11839.70×104t，增长14.38％[10]。陈杰等（2014）在利用微生物处理畜禽粪便的研究中表明，我国畜禽粪便年产量为21.7×108t，是工业废弃物的2.7倍，并且仍呈现上升趋势[11]。据预测2020年中国畜禽粪便排放总量达到42.44×108t[12]。畜禽粪便的直接排放不但会污染环境，而且对资源也是一种极大的浪费[13-14]。

　　1.1.2畜禽养殖废弃物与水污染

　　在我国《第一次全国污染源普查公报》中有关污染物的排放报告曾经表明，畜禽养殖主要水污染物中化学需氧量（COD）的排放已经达到1268.26×104t，除此之外总氮的排放量达到了102.48×104t，总磷的排放量达到了16.04×104t[15]。由畜禽粪便排放带来的大量COD、生化需氧量（BOD）可造成地表水浑浊、变黑，影响水的浊度和色度等[16]。未经处理的畜禽粪便中含有过量的营养物质，如N、P等，进入水体会引起水质富营养化，当这种富营养化现象超过水体本身的自净能力时藻类和浮游生物将会大量繁殖，水体的生态平衡遭到破坏，与此同时，造成水体氧气含量降低，鱼类生物死亡。当氮被氧化成硝酸盐渗入地下水中被人类所饮用将产生不良后果[17]。而且受污染的水质很难恢复，有研究表明地下水一旦受到污染，要经过300年的时间才能恢复。除此之外畜禽的排泄物中含有的病原微生物和寄生虫卵等很容易会造成疾病在畜禽之间的传播，严重影响牲畜和家禽的生长，甚至导致其死亡，而且这些微生物很容易随着水体或畜产品进入人体，严重威胁人类健康。

　　1.1.3畜禽养殖废弃物与大气污染

　　畜禽养殖中未消化的蛋白质类养分会随着粪便排出，经过厌氧发酵之后能够释放出NH3、H2S、胺等气体，这些有害气体将会对大气环境造成严重污染[18]。研究表明一个年产量为10.8×104头的养猪场平均每小时可以产生159kgNH3、14.5kgH2S、25.9kg粉尘和15×108个菌体，污染半径可以达到4.5~5.0公里，对环境造成了严重的危害。NH3的挥发与酸雨的形成有密切的联系，NH3能造成酸沉降，其中约有55%的酸沉降是因为畜牧业的生产所造成的[19]。养殖过程中会产生大量的温室气体其中CH4的产生对全球变暖的影响已经达到了15%[20]。而畜禽养殖是CH4产生的一个主要来源，其中牛羊等反刍动物是CH4、CO2的重要释放者[21]。同时相关研究表明在因粪便而产生的CH4中，中国在排放量上居世界第三位，因为农业生产而造成的N2O中，约有30%都与畜禽养殖有关[20-21]。臭气中的NH3、H2S和CH4等可使畜禽的生产性能和抵抗力降低，生长速度缓慢，甚至不愿采食失去知觉；浓度过高将会导致畜禽中毒而死，同时也会对养殖人员的健康造成一定的影响[22]。

　　1.1.4畜禽养殖废弃物与土污染

　　畜禽养殖废弃物在土壤污染方面主要表现为重金属污染和抗生素污染。

　　（1）重金属污染在畜禽的饲养过程中添加适量的重金属元素可以调节动物代谢并增强畜禽的抗病能力，例如添加高含量的Cu可以促进畜禽的生长，添加高含量的Zn能够预防畜禽腹泻。但是这些重金属在畜禽体内的利用率极低，有很大一部分都随畜禽废弃物排出体外[23]。据报道，截止到目前，我国每年使用30×104t~38×104t的微量元素添加剂[24]。其中随畜禽粪便排出的Cu、Zn含量超过了95%[25]，有关研究表明畜禽对无机镉的吸收率也比较低只有1%~3%[26]。在我国《第一次全国污染源普查公报》中有关水污染物的排放报告中曾经表明，铜的排放量是2397.23t，锌的排放量是4756.94t。进入土壤中的重金属因为很难被微生物分解，从而在土壤中不断累积[27]。不仅会导致土壤的成分发生变化，而且土壤的结构和功能也会受到影响，作物根系的生长和光合作用的合成都将会受到抑制，致使作物产量降低或绝产[28]。Zn、Cd、Pb、Cu等这些重金属一旦通过食物链进入人体，将会减缓儿童的认知能力，对人类的神经系统和呼吸系统、内分泌系统都有一定的影响[29]。研究表明植物对铜的毒性响应最为敏感，植株的高度与重金属铜的浓度呈现负相关性[30]，过量的铜还能抑制氨基酸的合成[31]，进入人体会导致人体中毒，溶血性贫血，严重者甚至会昏迷、死亡[32]；栅藻细胞对镉污染反应较为敏感，重金属镉能够破坏栅藻细胞的叶绿体，并且使栅藻细胞的细胞质萎缩。镉一旦随食物链进入人体，将会形成镉蛋白，对人体内的某些器官造成损伤，干扰酶系统的正常运行，造成骨质疏松甚至引发癌症[33-34]。

　　铅不仅能对植物的叶绿体进行破坏使光合作用不能正常进行[35-36]，而且还能抑制某些酶的活力并破坏线粒体结构，阻碍植物呼吸作用的正常进行[37-38]。铅对人类健康也有很大影响，铅可以使人体内红细胞发生改变，造成贫血，还可能导致忧郁麻痹症，生理和行为都会受到影响[39]。庞金华（1994）在Co、Zn污染对水稻的危害研究中发现，随着Zn浓度的增高，会导致株高减少，Zn含量为2000mg·kg-1时，会导致水稻幼苗是枯黄,甚至死亡[40]。除此之外重金属对鱼类的健康也存在危害，高浓度的重金属溶液能够在短时间内造成鱼类的免疫功能下降[41]。铜、锌、锰的存在对鱼的性别和体长也会产生影响[42]。贾武霞等（2016）在对我国部分城市畜禽粪便中重金属含量及形态分布的研究中表明畜禽粪便中重金属Cu的平均含量为377.51mg·kg-1，Zn的平均含量为1610.4mg·kg-1、Pb的平均含量为6.31mg·kg-1、Cd的平均含量为0.72mg·kg-1[43]。从表1.2中可以看出来，我国不同地区畜禽粪便中主要重金属残留状况存在明显差异[44]。结合表1.3，对照不同的标准对全国11个省市的畜禽粪便中重金属超标状况分析可知，超标情况严重，急需进行相关处理。

　　（2）抗生素污染抗生素不但能够治疗疾病，而且将其添加到饲料中，也能加快畜禽的生长。因此，兽用抗生素在畜禽的养殖方面得到了较为广泛的应用，我国近年的饲料抗生素消耗量可以达到6000t/a[45]，其中四环素类抗生素占的比例最大为57%[46]。但有研究表明饲料抗生素中仅仅很少一部分才能被畜禽吸收、利用，大部分会排到环境中[47-50]。当使用含有抗生素的畜禽粪便作为肥料时，将会诱导出土壤微生物的抗性基因并造成严重的生态污染[51]。例如将牛粪施于花园后，导致该土壤对特定抗生素抗性增加70%[52]。抗生素对环境的影响主要是破坏生态系统平衡和威胁人类健康两方面[53]。有研究表明1mg·kg-1的四环素能够抑制土壤中的酶活力[54]。与此同时四环素类抗生素会因与叶绿体结构相似而抑制它的活性，从而抑制植物的生长，影响植物根的生长和植物发芽率。

　　詹杰等（2015）在关于四环素的分布及毒性降解的研究中也发现四环素可以通过抑制铜绿微囊藻的光合作用而影响藻类的生长[55]。刘娣等（2017）发现四环素类抗生素对人体健康也存在很大威胁，四环素类抗生素进入人体后会对人体的代谢功能产生影响，甚至会病变出耐药细菌，最终导致无药可医[56]。于晓雯等（2018）研究发现土壤微生物多样性会因土壤中存在过多的四环素类抗生素而产生变化，降低其对其他有机物的分解能力，抑制土壤呼吸作用和土壤酶活性[57]。

　　1.2畜禽养殖粪便无害化处理技术研究

　　畜禽粪便中含有大量的N、P等养分物质使其可以作为肥料施于农田促进农作物生长，但是土壤的自净能力有限，一旦土壤中N、P等养分物质的含量过高超出其自净能力时，将会改变它的理化性质，堵塞土壤空隙，使土壤的降水性和透气性下降，致使农作物减产[58]。除此之外，畜禽粪便中的病原微生物和寄生虫卵等可长期在环境中生存甚至繁殖[59]，对生态环境造成污染，而且病原微生物极易通过富集作用进入食物链，对人类和牲畜健康构成威胁。无害化处理过程就是将畜禽粪便中原有的养分物质合理利用，把重金属残留量控制在合理范围内，减少污染，同时将其作为农业生产的有机肥料使用，使其得到资源化利用。根据国内外的研究进展可以将畜禽粪便无害化处理技术分为饲料化、肥料化和能源化三种[60]。

　　1.2.1饲料化

　　畜禽粪便含有的营养物质和矿质元素为其作为饲料喂食动物提供可能。但由于其含有的病原微生物、重金属及农药残留等，必须先处理才能使用。程文定等（2006）研究发现经沸石生物处理剂处理的畜禽粪便各项指标都符合相关的卫生标准，用处理过的饲料饲喂畜禽，结果表明这种方法不仅能将饲料成本降低10.31%~12.04%，而且还能将饲料转化率提高3.73%~5.16%[61]。畜禽粪便还可以通过饲养蝇蛆、蚯蚓等低等动物作为饲料资源。有研究表明以鸡粪喂食的蝇蛆其体内的粗蛋白含量可以达到61.4%，并且含有多种丰富的必须氨基酸[62]。马艳华等（2018）在畜禽粪便无害化处理的技术研究中发现鲜蚯蚓含35%左右的蛋白质，被蚯蚓分解后的畜禽粪便，是比较好的园艺种植肥，也可用于养鱼等养殖业的辅料[63]。

　　1.2.2肥料化

　　畜禽粪便的肥料化是指将经过处理的畜禽粪便用作肥料，由于畜禽粪便含有丰富的氮磷钾和其他有机物质，是一种珍贵的资源[64]。这种方法的优点就是比较干燥、易包装施撒，对作物的生长发育具有很大的意义[65]。畜禽粪便肥料化最常见的方法是进行堆肥处理，通过微生物与畜禽粪便的相互作用使粪便无害化。有研究表明在堆肥过程中加入适宜的微生物菌剂可达到更好的堆肥效果。丛林（2013）在微生物菌剂对畜禽粪便堆肥过程中养分及腐熟度动态变化规律的研究中发现接种外源微生物菌剂处理后堆体初期升温迅速，并能加快有机质的分解，缩短堆肥周期[66]。宋文忠（2018）研究表明添加微生物菌剂可提高堆肥产品质量，促进芍药生长[67]。堆肥后的畜禽粪便，致病菌、寄生虫等有害物质都能很好的去除，实现了畜禽粪便的无害化，净化和改善了环境质量。

　　1.2.3能源化

　　能源化技术就是指以厌氧发酵为核心的能源环保工程[68]，畜禽粪便的能源化通常包括用作燃料供能和发酵产气。有研究表明加州将燃烧牛粪得到的热量驱动发电机发电，每天可以处理900t牛粪，能够为当地2万户居民供电[62]。在我国原牧区的蒙古族和藏族将畜禽粪便用作燃料的现象也较为普遍[69]。将畜禽粪便用作沼气发酵也是解决能源短缺的重要手段之一。据估算2009年可由畜禽粪便产生的沼气约为1198.44×108m3[70]。有关研究表明南平市仅在2013年这一年的时间里猪的粪便资源就能够产生沼气1.10×108m3，牛粪便资源能够产生沼气0.20×108m3，鸡粪便资源能够产生沼气0.80×108m3[71]。据估计华东地区在2015年可利用畜禽粪便产生的沼气量为135.1×108m3[72]。沼气开发率较低但开发潜力巨大，如何经济高效的实现畜禽粪便的沼气发酵也是未来急需解决的问题之一。

　　1.3研究目的与意义

　　畜禽粪便的无害化处理符合我国生态可持续发展要求，以及我国在2014年1月1日开始实施的《畜禽养殖污染防治条例》中的相关规定[73]，同时符合“十三五规划”中关于发展生态友好型农业的相关要求[74]。在畜禽粪便的无害化处理过程中加入适宜的外源添加物可显着提高降解效率，同时也可以提高肥效。为此，本文以畜禽粪便无害化为研究目标，分析筛选最优淋洗剂、纤维素降解菌并进行鉴定，通过对畜禽粪便无害化处理过程中微生物多样性的变化进行分析，从而为我国畜禽粪便无害化处理提供可行性途径。

　　1.4研究内容与方法

　　本研究采用壳聚糖、EDTA、柠檬酸钠作为淋洗剂，对畜禽粪便进行淋洗，通过淋洗作用洗脱其中的重金属残留，筛选出有效的淋洗剂。迄今为止堆肥法是畜禽粪便无害化处理的一个重要途径，堆肥过程中微生物将高分子有机物发酵分解成氨基酸、葡萄糖等，同时生产可被植物直接利用的N、P、K等化合物[58]。维持适宜的水分含量是保证畜禽粪便顺利堆肥的一个前提条件，但纤维类物质能够吸附水分，阻碍水分子运动，所以添加适宜的外源菌剂降低纤维素含量能使畜禽粪便更好的完成堆肥，实现无害化处理。本研究采用刚果红染色法在混合堆肥的土样中分离、筛选出纤维素降解能力较强的菌株，并进行形态学鉴定，生理生化检测和分子鉴定。堆肥法的本质是由群落结构演替非常迅速的多个微生物群体共同作用分解有机物的动态过程[58]。运用16SrDNA测序技术获取的细菌信息较为丰富，利用高通量测序技术对畜禽粪便无害化处理时的微生物多样性进行分析，比较不同外源添加物处理时畜禽粪便的微生物群落组成，为今后无害化处理提供了参考。

　　1.5技术路线
 

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　　第 2 章 重金属去除与淋洗剂筛选
　　2.1 材料与方法
　　2.1.1 实验材料
　　2.1.2 淋洗剂制备
　　2.1.3 实验设计
　　2.1.4 研究方法
　　2.1.5 重金属检测及计算

　　2.2 结果与分析
　　2.2.1 三种淋洗剂对畜禽粪便中重金属 Cu 的去除效果比较
　　2.2.2 三种淋洗剂对畜禽粪便中重金属 Zn 的去除效果比较
　　2.2.3 三种淋洗剂对畜禽粪便中重金属 Pb 的去除效果比较
　　2.2.4 三种淋洗剂对畜禽粪便中重金属 Cd 的去除效果比较
　　2.3 本章小结

　　第 3 章 畜禽粪便中纤维素降解菌的分离、筛选与鉴定
　　3.1 材料与方法
　　3.1.1 样品材料
　　3.1.2 菌株的分离与纯化
　　3.1.3 菌株鉴定
　　3.2 结果与分析
　　3.2.1 菌株的筛选
　　3.2.2 菌株的鉴定
　　3.3 本章小结

　　第 4 章 不同外源添加物对畜禽粪便中微生物多样性的影响
　　4.1 材料与方法
　　4.1.1 样品材料
　　4.1.2 主要试剂和仪器
　　4.1.3 研究方法
　　4.2 结果与分析
　　4.2.1 OTU 分析
　　4.2.2 Alpha 多样性分析
　　4.2.3 样品微生物群落结构分析
　　4.2.4 聚类分析
　　4.3 本章小结

第5章结论与展望

　　5.1结论

　　（1）在畜禽养殖过程中添加重金属元素可以提高畜禽抵抗力、促进畜禽生长，但是畜禽对这些重金属的利用率非常低，有很大一部分都随畜禽废弃物排出，不仅会对环境造成污染，而且也会影响人类健康。因此在畜禽粪便资源化利用前去除其中的重金属残留是当务之急。本研究是在畜禽粪便无害化处理过程中别添加壳聚糖、EDTA、柠檬酸钠，对畜禽粪便进行淋洗，分别检测淋洗液中Cu、Zn、Pb、Cd四种重金属含量，筛选最优淋洗剂。Cu污染严重的畜禽粪便，三种淋洗剂的淋洗效果排序EDTA>壳聚糖>CK>柠檬酸钠，EDTA的淋洗效果最好，淋洗率总和为33.67%，但在快速淋洗方面壳聚糖占优势，壳聚糖在前两个小时的淋洗率达到21.45%，而其他三组淋洗率在前两个小时仅为8.8%~15.65%；Zn污染严重的畜禽粪便，三种淋洗剂的淋洗效果排序壳聚糖>EDTA>CK>柠檬酸钠，壳聚糖的淋洗效果最好，淋洗率总和为44.14%而且在第二个小时淋洗率最高，到达23.42%，另外三组在第二个小时的时候淋洗范围为6.47%~12.73%；Pb污染严重的畜禽粪便，三种淋洗剂的淋洗效果排序EDTA>壳聚糖>CK>柠檬酸钠，EDTA的淋洗效果最好，淋洗率总和为54.66%，但在快速淋洗方面还是壳聚糖占优势，壳聚糖在第一个小时和第二个小时的淋洗率分别为19.79%和23.00%，明显高于另外三组；Cd污染严重的畜禽粪便，三种淋洗剂的淋洗效果排序EDTA>柠檬酸钠>壳聚糖>CK，EDTA的淋洗效果最好，淋洗率总和为58.73%，壳聚糖在快速处理方面占优势，前两个小时的淋洗率之和达到了40.53%。壳聚糖虽然在快速淋洗方面占优势，但EDTA在淋洗总量上占优势，在工艺生产中，可将两种淋洗剂相结合使淋洗效果更好。在重金属Zn的去除上，可以选用壳聚糖作为淋洗剂，因为壳聚糖在处理Zn污染的畜禽粪便时不仅具有快速性而且也具有高效性；在重金属Cu、Pb的去除上，可以选用壳聚糖+EDTA组合，从而达到快速高效的处理；而在重金属Cd的去除方面可选用壳聚糖+EDTA组合或者壳聚糖+柠檬酸钠组合达到良好的处理效果，两种方案可结合经济成本和操作的方便性进行选择。

　　（2）畜禽粪便堆肥处理后用作肥料是其资源化利用的一个主要途径。但由于畜禽粪便本身含有纤维素类物质，再加上稻草的引入无疑增加了堆肥时的水分控制难度。本研究采用刚果红染色法直接从畜禽粪便中分离出可降解纤维素的菌株，并根据刚果红培养基中各菌落周围透明圈的大小筛选出纤维素降解能力强的菌株X-3。对X-3进行形态学观察发现该菌种为杆状菌；将X-3菌种穿刺接种在半固体琼脂培养基中并透光观察，发现穿刺线边缘呈云雾状，说明X-3菌株具有运动性。生理生化分析结果表现为：甲基红试验和柠檬酸盐利用都呈阳性，接触酶结果呈阴性，氧化发酵试验表现为氧化型，耐盐性试验表现为5%盐度时菌株长势最好，3%和7%盐度次之，10%盐度时菌株长势稍差，几乎不生长。对目的菌株X-3的16SrRNA片段进行测序，所获序列长度为583bp。运用NCBI数据库中的BLAST工具进行序列比对并运用MEGA7.0构建系统发育树，结合菌体的形态学鉴定及生理生化检测结果初步确定菌株X-3为嗜麦芽窄食单胞菌。

　　（3）对不同外源添加物处理后的畜禽粪便进行高通量测序并分析，比较不同外源添加物对畜禽粪便的微生物多样性的影响，为今后的无害化处理提供理论参考。测序共得到273342条有效序列，17424个OTU。对各样品的Alpha多样性指数进行统计并分析，结果表明T3组的ACE和Chao1指数均最高，说明YH2菌剂和X-3菌剂的加入，对该环境下的纤维素和抗生素起到了降解作用，使该环境更适宜微生物生长，导致其物种丰度高于单独菌剂处理的样品。复合菌剂的使用加速了无害化进程，使堆肥效果更好。CK组的群落结构较简单，T2组和T3组的Shannon指数较高，物种分布均匀。在门分类水平上，共检测分类38个菌门，其中变形菌门占明显优势（41.3610%~45.0427%），其次为拟杆菌门、芽单胞菌门、放线菌门；在属分类水平上，共检测到852类菌属，其中未分类菌属、芽单胞菌属都是明显的优势菌属。拟杆菌门是碳循环主要功能菌，在T1和T3组含量较高。放线菌可以降解土壤中的农药残留，调整土壤微生态环境，而且能够提高植物抗性。四种样品中检测到的放线菌门丰度比例为4.0965%~6.6346%，说明处理过后的畜禽粪便用作肥料时，不仅能够提供肥效，而且还能够降解农药残留。T3中的绿弯菌门明显高于其他三个样品，有研究表明绿弯菌门细菌能够利用光合作用产生能量并且对于土壤环境的污染有一定的降解功能，说明复合菌剂的使用不仅加速了畜禽粪便的无害化处理过程而且还能降低土壤环境污染。通过对高通量测序结果及微生物多样性进行分析可知，外源菌剂的加入可以增加堆体中物种的多样性，加速无害化处理进程。而且堆肥过程中纤维素降解菌和抗生素降解菌的联合使用，不但能加快畜禽粪便的无害化处理，而且其用作肥料时还能够调整土壤微生态环境，降解农药残留，减少环境污染，使畜禽粪便在资源化利用方面表现出优势。

　　5.2创新点

　　（1）采用高通量测序技术对处理后的畜禽粪便的微生物多样性进行分析本课题采用高通量测序的方法对不同处理后的畜禽养殖粪便进行宏基因组提取并鉴定，对微生物的种类及数量进行系统分析，从微生物结构多样性的角度进行分析畜禽养殖粪便无害化处理过程中微生物的变化。

　　（2）多种处理方式相结合本课题采用三种处理方式相结合的方法完成畜禽粪便的无害化处理，即：①在畜禽粪便无害化处理过程中分别添加壳聚糖、EDTA、柠檬酸钠，对畜禽粪便进行淋洗，分别检测淋洗液中Cu、Zn、Pb、Cd四种重金属含量，筛选最优淋洗剂。②筛选纤维素降解菌株，降解堆肥时的纤维素含量，保证堆肥的顺利进行。③堆肥时同时加入抗生素降解菌和纤维素降解菌，增大堆体的物种丰度，加快无害化处理进程。

　　5.3展望

　　畜禽粪便的直接排放不但会污染环境而且也是一种资源浪费。关于畜禽粪便的无害化处理和资源化利用是目前国内外科学研究的热点问题。

　　（1）本研究在畜禽粪便无害化处理过程中分别添加壳聚糖、EDTA、柠檬酸钠，对畜禽粪便进行淋洗，分别检测淋洗液中Cu、Zn、Pb、Cd四种重金属含量，筛选最优淋洗剂。结果表明壳聚糖+EDTA能达到最优的淋洗效果的理论参考，但是相继使用壳聚糖与EDTA，两种淋洗剂之间可能会产生拮抗或者对彼此原有的淋洗能力产生影响，所以在接下来的研究中，可以将这个理论结果运用到实际生产工艺中，确定结果的可行性

　　（2）实现畜禽粪便的资源化利用应根据实际情况，从养殖空间分布到畜禽排泄物的无害化处理形成一套完善的体系，从而使畜禽粪便对环境零污染且得到最大程度的利用。一个地区的自然环境容纳量有限，如果当地的畜禽养殖业不加以控制，污染物随意排放，超过了当地环境容纳量的极限就会对当地生态造成极大的破坏，不仅污染环境也会影响当地经济的发展，同时许多空间布局不合理的畜禽养殖企业，也会对自然保护区，居民小区，公共场所带来污染，加大了污染防治的难度。合理规划畜禽养殖的空间分布和控制养殖的数量和规模，对地区发展有着深远的影响，同时合理的畜禽养殖分布也对畜禽养殖业的良好发展有着不可替代的作用。对于养殖集中区域，我们可以采用集中式处理，例如在畜禽粪便排放量大的区域建立有机化肥厂，可以将畜禽粪便统一收集起来，回收加工成有机肥料，实现废物利用，这样不仅可以降低畜禽粪便对环境造成的污染，而且也可以带来经济效益，减少环境污染防治的成本，而其他畜禽养殖分散地区可以采取分散式处理方式进行处理，或者规模较小的养殖户，可以建立沼气池，发酵燃料，而底料还可以作为种植肥料。农村个体畜禽养殖户粪便可以直接发酵作为有机肥，投入到农田种植中。

　　参考文献

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