引言：

目前，来源于多种菌株的海藻糖合酶基因均已在大肠杆菌中实现了表达。然而产海藻糖合酶基因工程菌普遍存在的产酶水平较低，酶制备成本较高等不利因素限制了其工业化应用。
基因工程菌(细胞) 的高密度发酵是外源基因实现高水平表达，获得大量外源基因产物的重要工艺技术。高密度发酵技术不仅可减少培养体积，强化下游分离提取，还可以缩短生产周期，减少设备投资从而降低生产成本，极大地提高其在市场上的竞争力。但外源蛋白的表达水平受宿主细胞、重组体的稳定性、培养基成分、培养方式、培养条件以及培养过程中抑制性代谢产物的积累等多种因素的影响，能否实现高密度培养及高目标产物浓度，是工程菌能否以较低成本实现规模生产的决定性因素。...........
本项目组从一株红色亚栖热菌中克隆得到了海藻糖合酶基因，并利用混合质粒PCR筛选的方法获得了其全长基因，构建了含有海藻糖合酶基因的大肠杆菌质粒（PET21TreS），并将其转化到大肠杆菌BL21a中，得到了重组海藻糖合酶的基因工程菌。本文以该工程菌为生产菌株，对其进行高密度发酵条件的优化和研究。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1菌种
海藻糖合酶基因工程菌（PET21TreS/ BL21（DE3）），由南开大学生命科学院构建，-20℃甘油冻干保存。
 

1.1.2 培养基平板培养基：LB固体培养基加终浓度100µg/mL的氨苄青霉素 种子培养基：LB液体培养基加终浓度100µg/mL的氨苄青霉素 高密度发酵培养基：选取大肠杆菌发酵常用培养基，并通过改良，比较了7种不同组分的培养基对海藻糖合酶基因工程菌高密度发酵的细胞密度与酶活的影响。
补料培养基：胰蛋白胨 128g/L；酵母粉80g/L；硫酸镁10g/L；葡萄糖448g/L 。

1.1.3试验试剂：胰蛋白胨、酵母粉、氨苄青霉素、IPTG、咪唑  北京鼎国昌盛生物技术有限公司；葡萄糖  天津光复科技发展有限公司，分析纯；泡敌 天津开发区乐泰化工有限公司，分析纯。

1.1.4实验设备：10-100L自控发酵罐，镇江东方生物工程设备技术有限公司；智能型超声波细胞粉碎机，上海之信仪器有限公司；恒温振荡器，太仓市科教器材厂；电子显微镜，日本HITACHI公司；超净工作台，天津医疗净化设备厂；高速冷冻离心机，湘仪离心机公司；双光束紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限公司。.................

2 结果和讨论

2.1高密度发酵培养基

试验通过摇瓶发酵对7种大肠杆菌常用培养基（见表1）进行了试验比较，发现以2YT加0.2%葡萄糖为发酵培养基时，工程菌的细胞密度和酶活均高于其它7种培养基。试验结果显示，在培养基中加入一定浓度的葡萄糖有助于菌体的生长，尤其在菌体生长的中后期，细胞密度较未加葡萄糖的提高35%，这说明海藻糖合酶基因工程菌在生长阶段，尤其是对数生长期对碳源和氮源的需求量比较大，而2YT培养基富含丰富的氮源，再加入一定量的葡萄糖，能满足菌体快速生长的需要。 ..........

3. 发酵方式的比较

  试验对分批发酵与分批补料发酵进行了比较（图3），分批补料培养过程中，试验采用了pH-stat法通过对发酵液进行定时补料和加碱，始终控制发酵液pH维持在7.0左右。取样检测结果显示，分批发酵的细胞密度生长速度很快，但20h后呈现出下降趋势，而分批补料发酵前期缓慢生长，但最高细胞浓度明显大于分批发酵。经进一步镜检发现，24h后分批发酵菌体有自溶现象（图4），而分批补料由于连续不断地为菌体生长提供了丰富的碳源和氮源， 24h后菌体仍保持正常分裂。.............

4结论

4.1海藻糖合酶工程菌高密度发酵条件的优化    
 

本实验通过对已构建的海藻糖合酶基因工程菌进行摇瓶发酵条件的研究，确定了海藻糖合酶基因工程菌高密度发酵的最适培养基为2YT培养基，发酵初始葡萄糖浓度为0.2%，菌体生长最适pH为7.0，最佳发酵方式为分批补料法。

4.2 10L自控式发酵罐高密度发酵的研究

  试验采用 10L自控式发酵罐，装液量为4L，发酵温度为37℃，pH为7.0，通气量为7L/min，罐压为0.05MPa。通过pH-stat法控制加碱和定时补料，发酵过程中以15%氨水控制加碱，在初始葡萄糖耗尽后（发酵4h）定时补料，将发酵液pH维持在7.0左右，补料方式为连续流加，补料液的体积为总发酵液的20%，流速为0.7ml/min，葡萄糖浓度维持在<1g/L，以减少副产物乙酸的生成，延长了工程菌对数期的生长时间，大大提高了菌体的发酵密度，最终得到的海藻糖合酶基因工程菌的细胞密度达到了50.78g/L。在发酵20h后加入浓度为1.0mmol/L的IPTG 诱导、诱导温度为37℃、诱导时间为4h，得到的重组海藻糖合酶的酶活达到了3197U/L，为LB摇瓶发酵的5倍。 .......

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